Công nghệ sinh học thực phẩm - Công nghệ Enzyme

*CHƯƠNG 2CÔNG NGHỆ ENZYME*Tài liệu tham khảoHóa sinh công nghiệp- Lê Ngọc TúCông nghệ enzyme- Đặng Thị ThuCông nghệ enzyme- Nguyễn Trọng CẩnCác tài liệu hóa sinhĐộng học các quá trình xúc tác sinh học- Trần Đình ToạiFood enzymes- Dominic .W.S. WongBiotechnology, volume 9- G.Reed and T.W. NagodawithanaFood biotecnology- R.D. King and P.S.J. Cheetham*CHẤT XÚC TÁC Thay đổi tốc độ phản ứng: dương, âm Giúp chuyển hóa lượng lớn chất phản ứng Tỉ lệ chất phản ứng: chất xúc tác lớn Sau phản ứng: không đi vào sản phẩm cuối, không biến đổi, không thay đổi số lượngH2 + O2  H2OplatineĐường bốc cháy, không caramel hóa, khi rắc lên 1 ít tàn thuốc lá (một số muối, oxit vô cơ)*ENZYME- Khái niệmChất xúc tác sinh họcDo sinh vật tổng hợpXúc tác phản ứng trong cơ thểĐặc tính:Cường lực cao: 1g pepsin, 5kg protein trứng (2h), 1 β-amylase, 4000 glucosideĐặc hiệuXúc tác mềm= điều kiện bình thường: 30-500C, pH trung tính, áp suất thường. . . .Bản chất: chủ yếu là protein*Amylase*Back *TÍNH ĐẶC HIỆU Chuyển hóa 1 hoặc 1 số ít cơ chất không tạo sản phẩm phụ Tuyệt đối: 1 cơ chất nhất định, vd ureaseTương đối= đặc hiệu liên kết hóa học: lipase: liên kết esterĐặc hiệu nhóm= đặc hiệu liên kết + điều kiện Carboxypeptidase: peptide gần –COOH tự do Đặc hiệu quang học: 1 trong 2 đồng phân, L hoặc D, cis hoặc transĐặc hiệu môi trường: chymoptrypsin, trypsin*BẢN CHẤT ENZYME- Protein phân tử lượng lớn: 20-1000kDa  không qua được màng bán thấmCầu tan trong nướcCó cấu trúc bậc 4 Dễ bị biến tính mất hoạt tính: nhiệt, acid, kiềm, kim loại năng. . .Lưỡng tính: âm, dương, trung hòa tùy pHCatalase*EnzymeENZYME 2 CẤU TỬ= ENZYME PHỨC TẠP= PROTEIN + PHI PROTEIN (Coenzyme: kim loại, vitamine. . .)ENZYME 1 CẤU TỬ= ENZYME ĐƠN GIẢN= CHỈ CÓ PROTEINamylase*GỌI TÊN TÊN THÔNG THƯỜNG: amylase, bromelinTÊN THƯƠNG MẠI: vd: neutrase là emzyme dùng trong sx bia của hãng Novo Đan Mạch THEO QUI ƯỚC QUỐC TẾ Phần 1: tên cơ chất đặc hiệu Phần 2: kiểu phản ứng enzyme xúc tác Phần 3: đuôi “ase”Vd: alcohol dehydrogenase= enzyme xúc tác phản ứng làm mất H của rượu*PHÂN LOẠILỚP (class)LỚP PHỤ(subclass)NHÓM(section)cùng tính chất đặc trưng cho phản ứng do enzyme xúc tác. 6 lớpcùng lớp nhưng tác động lên nhóm chức hoặc liên kết kháccùng lớp phụ, cơ chất khác *6 LỚP ENZYMEEC 1: Oxyreductase: oxi hóa khửEC 2: Transferase: chuyển nhóm chứcEC 3: Hydrolase: thủy phânEC 4: Lyase: tách nhóm chức không cần nước EC 5: isomerase: đồng phân hóaEC 6: ligase: tạo liên kết có ATP tham gia*OXYREDUCTASE: oxi hóa khửCó 4 nhómDehydrogenase:Tách H trực tiếp từ cơ chấtCó các coenzyme: NAD+, NADP+, . . .Có vai trò trong sinh tổng hợpVd: alcohol dehydrogenase, chuyển rượu thành aldehydCH3CH2OH + NAD+  CH3CHO + H+OxidaseChuyển e- đến Oxi oxi có khả năng kết hợp với proton Vd: Cytocrom C oxydase xúc tác4 ferrocytocrom C + O2 + 4H+  4 ferrocytocrom C + H2O*OxygenaseXúc tác phản ứng kết hợp oxi vào hợp chất hữu cơGồm oxygenase (kết hợp O2) và hydroxylase (kết hợp OH)PeroxydaseXúc tác oxi hóa các chất hữu cơ khi có H2O2Điển hình là catalase, giải độc H2O2 cho cơ thểVd: catalaseH2O2 + H2O2  O2 + 2H2OOXYREDUCTASE: oxi hóa khử*Xúc tác chuyển các gốc, nhóm từ chất này sang chất khác. Tùy bản chất nhómAcyl-transferase: chuyển nhóm acyl, quan trọng trong trao đổi chấtGlucozyl-transferase: chuyển gốc đườngAmino-transferase: chuyển amin từ acid amin sang α-ketoacid acid amin mớiPhospho-transferase (kinase): chuyển gốc phosphat từ ATP đến –OH của alcohol hoặc đườngTRANSFERASE*Xúc tác phản ứng thủy phân, luôn có nước tham giaKhông cần coenzymeQuan trọng trong quá trình tiêu hóaPeptihydrolase: thủy phân liên kết peptideLipase (esterase): thủy phân liên kết ester trong dầu mỡGlycoside hydrolase: thủy phân glucoside trong tinh bột, celluloseHYDROLASE*LyaseTách nhóm chức không cần nướcVí dụ: pyruvat-decarboxylase, loại CO2 khỏi pyruvat  AcetaldehydXảy ra trong quá trình lên men rượuCH3COCOO-  CH3CHO + CO2isomeraseĐồng phân hóa hình học, quang học, chuyển vị nội phânVí dụ: Glucoisomerase chuyển glucose thành fructose*Ligase Xúc tác tổng hợp các chất hữu cơ Ví dụ:Pyruvat-carboxylase chuyển C đến acid pyruvic và tạo thành oxaloaceticTrong chu trình krebs quan trong trong trao đổi chất*CƠ CHẾ PHẢN ỨNGLàm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứngVí dụ: H2O2  H2O + O2- Năng lượng hoạt hóa: 18 kcal/mol- Có xúc tác hóa học platin: 11,7 kcal/molCó enzyme: 5,5 kcal/molNăng lượng hoạt hóa giảm tốc độ phản ứng tăng lên**3 giai đoạnCƠ CHẾ PHẢN ỨNGE + SESP + EGiai đoạn 1:- Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu- Tạo phức enzyme-cơ chất (ES)- Xảy ra nhanh, cần ít năng lượngGiai đoạn 2:Biến đổi cơ chấtKéo căng đứt liên kết đồng hóa trịGiai đoạn 3:Tạo sản phẩm (P)Giải phóng E tự do*TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNGLà một phần rất nhỏ của phân tử enzymeGồm:Tâm xúc tác: tham gia vào hoạt động xúc tácMiền xúc tác: tham gia tạo liên kết với cơ chất*TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNGTâm hoạt động có thể là:- Các nhóm chức của phần protein- Các nhóm ngoạiCác nhóm tạo tâm hoạt động xa nhau trong mạch peptide nhưng gần về không gian. Đủ gần để tương tác**Tâm hoạt động - S: tương ứng về cấu trúc theo kiểu:*Các nhóm chức ở tâm hoạt động thay đổi vị trí tạo hình thể E khớp với S mềm dẻo*TÂM ĐIỀU HÒAAllosteric siteTrên enzymeKhác vị trí tâm hoạt độngĐiều hoà hoạt động của enzymeKết hợp với chất điều hòa thay đổi cấu trúc enzyme thay đổi hình thể tâm hoạt động thay đổi khả năng xúc tác của enzymeChất điều hòa: kiềm hãm hoặc hoạt hóa*cartoon*HOẠT TÍNH ENZYME Là mức độ hoạt động của enzyme cần xác định hoạt tính. 3 phương pháp:Đo S mất đi hoặc P tạo thành (nồng độ E không đổi)Đo thời gian thu 1 lượng cơ chấtĐo nồng độ E cần để thu được lượng P nhất định Đơn vị hoạt tính: 1UI= lượng E chuyển hóa 1µmol cơ chất /phút (điều kiện tiêu chuẩn)*HOẠT TÍNH ENZYME Hoạt độ của một chế phẩm enzym: số UI trong 1ml hoặc 1mg Hoạt độ riêng phân tử: số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi 1 phân tử E Xác định hoạt tính E cần chú ý:[S]: thích hợp, đủ nhưng không quá caoCho chất hoạt hóa, chất làm bền vào trước, loại chất kiềm hãmpH thích hợp, ổn địnhNhiệt độ: thấp hơn nhiệt tối ưuThời gian:5-30phút. Quá dài cần chất diệt vsv*ỨNG DỤNG CỦA ENZYMETrong thực phẩm:bia, nước giải khát: amylase, papain, pectinaseThực phẩm dinh dưỡng cao: thủy phân protein người không thể tiêu hóa (vd: tảo). . .Trong y dượcTính đặc hiệu điều chế dược phẩm vd: chitin chitinase, esterase glucosamin kháng sinhChữa bệnh: ribonuclease chữa bệnh nhiễm virus (vd: viêm não)Phát hiện bệnh: aldolase: viêm gan; creatinkinase: nhồi máu cơ tim. . .*ỨNG DỤNG CỦA ENZYMETrong phân tích- Cơ chất sản phẩm phát hiệnPhủ enzyme lên điện cực phát hiệnĐộ nhạy cao (106 phương pháp hóa học)Sản xuất và định lượng kháng sinhKháng sinh bán tổng hợp: bền, ít độc, hoạt tính mạnh, không dị ứngVsv kháng sinh enzyme kháng sinh bán tổng hợpVd: penicillin (do Penicillin chrysogenum) penicillinase, acylase penicillinic acid**ỨNG DỤNG CỦA ENZYMEMột số ngành công nghiệp khác:Thuộc da: protease làm mềm, tách lông, daGiặt tẩyMỹ phẩmGiấy. . .Giải quyết vấn đề năng lượngHydrolase, năng lượng mặt trờiChuyển H2O thành H2Chuyển năng lượng mặt trời thành năng lượng dự trữ - H2 tạo năng lượng không ô nhiễm**ĐỘNG HỌC ENZYME*PHẢN ỨNG BẬC 11 cơ chất sản phẩm: SPkk: hằêng số vận tốc phản ứng (1/s)v: vận tốc phản ứng (mol/s)v=-d [S] dt=d [P] dt=k [S][S]: nồng độ cơ chất (mol/lít)Khi t tăng v giảm và tiến về 0, [S] giảmk phụ thuộc S*PHẢN ỨNG BẬC 22 cơ chất 1 hoặc nhiều sản phẩm: A + BCkk: hằêng số vận tốc phản ứng (mol/s)v=d [C]d t=k [A][B] Nếu A>>B  [A] = [A]0 = const  v = k’[B](Với k’= k[A]0) xem như phản ứng bậc 1 (ví dụ phản ứng thủy phân) v biến đổi theo thời gian tạo đk để v không đổi= đk ban đầu đo được vận tốc đầu*[S] thấp: phản ứng bậc 1[S] cao: phản ứng bậc 0*Phản ứng tạo phức tạm thời enzyme-cơ chấtE + SES P + Ek1k -1k2k -2Phản ứng xảy ra theo 3 pha:Pha tiền dừng: tạo phức ES, nhanh, tăng theo t, kéo dài vài phần ngàn giâyPha dừng: [ES] cực đại, P tăng , v=vận tốc đầu, P ít, bỏ qua chiều nghịch, vài phút, vài chục phútPha sau dừng: S cạn, ES giảm, v giảm0MÔ HÌNH PHẢN ỨNG MICHAELIS*Các pha phản ứng enzyme 1 cơ chất*E + SES P + Ek1k -1k2k -2Phản ứng xảy ra theo 2 giai đoạn:Giai đoạn đầu:E + SESk1k -1Chiều thuân: phản ứng bậc 2, k1: hằng số kết hợp (mol/s)Chiều nghịch: phản ứng bậc 1, k-1: hằng số phân ly (1/s)k1k -1=kalTỉ sốkal: hằng số ái lực của enzyme đối với cơ chất*Giai đoạn 2: giai đoạn xúc tácXảy ra một chuỗi các phản ứngES  EP  E + PPhản ứng bậc 1kcat: hằng số xúc tác (1/s)Giai đoạn 2 dài hơn 1 kcat> Km: [S] rất lớn, v=Vmax, không phụ thuộc [S]Khi [S]=Km: v= ½ Vmax*Ý NGHĨA CỦA HẰNG SỐ KmDo kcat<< k1 nên Km= 1/kal biểu thị ái lực enzyme-cơ chấtKm càng lớn, ái lực enzyme-cơ chất càng béCùng enzyme,Với những cơ chất khác nhau, Km càng nhỏ  cơ chất càng thích hợp Km= (k-1+ kcat)k1=1kal+kcatk1*XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌCv= Vmax [S]Km+ [S]Phương trình Michaelis- MentenPhương trình Michaelis- Mentennghịch đảo= KmVmax 1v 1[S] + 1Vmax DaÏng: y= ax+b*Phương pháp đồ thị theo Lineweaver-Burk= KmVmax 1v 1[S] + 1Vmax *Phản ứng enzyme nhiều cơ chấtPhần lớn là phản ứng enzyme 2 cơ chấtÍt gặp phản ứng vượt quá 3 cơ chất, 3 sản phẩmA + BP + QECơ chế: tạo nhiều tổ hợp Enzyme-cơ chấtTổ hợp 2 (binary)Tổ hợp 3 (ternary)Có 4 mô hình phản ứng chính*Bi Bi có trật tựVận tốc phản ứngABPQEEAEABEPQEQE+ = 1Vmax 1v kB[A] kAkB[A][B] + 1 Xác định các tham số đặc trưng*- Cố định [A]- Vẽ đồ thị 1v = f 1[B] - Cố định [B]- Vẽ đồ thị 1v = f 1[A] *Bi-Bi bấp bênhVận tốc phản ứngA, B gắn kết với E một cách ngẫu nhiên tạo tổ hợp 3Sản phẩm cũng giải phóng theo trật tự bấp bênhABPQEEABEPEBAEAEBAPQQPEQ= 1Vmax 1v kB[B] + kAkB[A][B] + 1 kA[A] + *Bi-Bi ping-pongVận tốc phản ứngCơ chất 1 gắn với E sp đầu tiênCơ chất 2 gắn vào sp 2F: dạng tạm thời của E trong quá trình phản ứng= 1Vmax 1v kB[B] + + 1 kA[A] AQEEAEBPEQFPFFB*Theorell-ChanceTương tự kiểu Bi-Bi có trật tự EAB nồng độ rất thấp, tồn tại rất ngắnPEQAQEEAEB