Chương 8 Các quá trình lên men(Phần 4)

Chương 8 Các quá trình lên men (Phần 4) VI. Lên men lactic và họ Lactobacteriaceae Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù nhóm này không có sự giống nhau về hình thái và, bao gồm cả vi khuẩn hình que dài, hình que ngắn lẫn các vi khuẩn hình cầu, song về mặt sinh lý chúng có chung các đặc điểm khá đặc trưng. Tất cả các đại diện đều là các vi khuẩn gram dương, không tạo thành bào tử (trừ Sporolactobacillus) và không di động. Để thu năng lượng chúng hoàn toàn phụ thuộc vào các hiđrat cacbon và tiết ra acid lactic (lactat). Đối lập với các Enterobacteriaceae là bọn cũng sản sinh acid lactic, chúng thuộc bọn lên men bắt buộc. Chúng khác chứa các hemin (xitocrom, catalase). Mặc dù vậy, các vi khuẩn thuộc họ Lactobacteriaceae có khả năng sinh trưởng khi có mặt oxi không khí, chúng thuộc bọn kị khí song đồng thời cũng là bọn chịu khí. Một vi khuẩn sinh trưởng hiếu khí mà không chứa catalase thì gần như chắc chắn đó là một vi khuẩn lactic (trừ ngoại lệ Acetobacter peroxydans và Shigella dysenteriae). 1. Nhu cầu về các chất bổ sung và nhân tố sinh trưởng Một đặc điểm nữa của các vi khuẩn lactic là có nhu cầu về các chất bổ sung. Không có đại diện nào có thể mọc được trên môi trường vô cơ thuần khiết chứa glucose và các muối amôn. Đa số trong chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin), và các acid amin, các bazơ purin và pirimiđin. Vì vậy người ta thường nuôi chúng trên các môi trường dinh dưỡng phức tạp chứa những số lượng khá lớn cao nấm men, dịch cà chua, dịch đường sữa hoặc thậm chí cả máu nữa. Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn lactic (và cả các vi khuẩn lên men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn lactic thiếu năng lực tổng hợp các pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số vi khuẩn lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng. Vi khuẩn lactic được coi như những kẻ què quặt về trao đỗi chất. Có thể rằng do hậu quả của sự chuyên hóa sinh trưởng trong sữa hoặc trên những môi trường giàu chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng, chúng đã mất đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đỗi. Trong khi đó chúng lại có khả năng mà đa số các vi khuẩn khác không có, đó là khả năng sử dụng lactose. Khả năng này nhiều vi khuẩn đường ruột (ví dụ Escherichia coli) cũng có. Lactose không có mặt trong giới thực vật, nó được các động vật có vú tạo thành và tiết ra cùng với sữa hoặc được hấp thu vào cùng với sữa. Việc sử dụng được lactose cũng có thể được xem như một sự thích nghi với các điều kiện tồn tại trong đường ruột của động vật có vú. Lactose là một đisaccarit, trước khi đi vào các con đường phân giải hexose nó phải được phân cắt : Lactose + H 2 O D-glucose + D-galactose Sau khi được phosphorin hóa galactose được chuyển thành glucosephosphate. Do có sự sản sinh một lượng lớn lactat nên môi trường dinh dưỡng cần phải được trung hòa. Thường người ta dùng cacbonat canxi. Trên một môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung cacbonat canxi có thể nhận ra sự tạo thành acid qua các vòng trong suốt bao quanh các khuẩn lạc. Nơi sống chủ yếu của các vi khuẩn lactic là sữa và những nơi sản xuất và chế biến sữa, thực vật nguyên vẹn hoặc đang tự phân hủy, cũng như đường ruột và niêm mạc của người và động vật. Do tạo thành một lượng lớn lactat và do tính chịu chua mà dưới các điều kiện môi trường thích hợp các vi khuẩn lactic phát triển nhanh, vì vậy có thể dễ dàng phân lập các vi khuẩn lactic trên các môi trường dinh dưỡng chọn lọc. 2. Lên men lactic đồng hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình tạo thành toàn bộ hoặc gần như toàn bộ là lactat. Chúng phân giải glucose qua con đường EM, chứa các enzyme cần thiết, kể cả alđolase và chuyển dihydro tách ra trong quá trình loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate sang piruvat : Glucose 2 Lactat Việc xuất hiện D-, L+ hay DL- lactat là phụ thuộc vào tính chuyên hóa không gian của enzyme vận chuyển lactat-đedihydrogenase và vào sự có mặt của một lactat-racemase. Chỉ một phần nhỏ piruvat được loại cacboxil và chuyển thành acetate, ethanol, CO 2 và acetoin. Việc tạo thành các sản phẩm phụ phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của oxi. 3. Lên men lactic dị hình Vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EM là alđolase và triosephosphate-isemerase. Đoạn phân giải glucose đầu tiên chỉ xảy ra qua con đường pentosephosphate, tức là qua glucose-6- phosphate, 6-phosphogluconat và ribulose-5-phosphate (hình). Chất này nhờ một epimerase được chuyển thành xilulose-5-phosphate và nhờ phosphoketolase được phân giải trong một phản ứng phụ thuộc taminpirophosphate làm xuất hiện glyceraldehyt-3-phosphate và acetilphosphate. Các tế bào Leuconostoc mesenteroides không sinh trưởng và được rửa sạch đã lên men glucose thành lactat, ethanol và CO 2 theo một tỉ lệ gần như tương đương: C 6 H 12 O 6 → CH 3 - CHOH - COOH + CH 3 - CH 2 - OH + CO 2 ở các cơ thể này acetilphosphate bị khử qua acetil-CoA và acetaldehit thành ethanol. Các vi khuẩn lên men dị hình khác chuyển một phần hoặc 2NADH 160 toàn bộ acetilphosphate thành acetate, trong đó liên kết phosphate giàu năng lượng được chuyển sang ADP và được sử dụng dưới dạng ATP. Dihydro thừa trong trường hợp này được truyền cho glucose làm xuất hiện manit. Glyceraldehyt-3-phosphate được chuyển qua piruvat thành lactat. Ribose được L. mesenteroides lên men thành lactat và acetate. *Lên men lactic dị hình ở Bifidobacterium Vi khuẩn lactic dị hình Bifidobacterium bifidum có dạng chữ V hay chữ Y (bifidus tiếng Hi Lạp có nghĩa là bị chia đôi, bị phân cắt), là thành viên trong khu hệ đường ruột của trẻ sơ sinh, trước hết là các trẻ nuôi bằng sữa mẹ. Vi khuẩn này cần N-acetilglucosemin chỉ có trong sữa người mà không có trong sữa bò. Các đại diện thuộc chi Bifidobacterium là những vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt, không chịu khí và cần một khí quyển chứa CO 2 (10% CO 2 ) để sinh trưởng. Bifidobacterium chuyển hóa glucose theo phương trình : 2 C 6 H 12 O 6 → 2 CH 3 - CHOH - COOH + 3 CH 3 - COOH Bifidobacterium lên men glucose qua con đường phụ phosphoketolase, không chứa aldolase cũng như glucose-6-phosphat-dehydrogenase, song lại chứa các phosphoketolase hoạt động, phân giải fructose-6-phosphat và xilulose-6-phosphat thành acetilphosphate và eritro-4-phosphate hoặc glixeraldehyt-3-phosphate. Hexose được chuyển hóa theo con đường sau đây Hình 6.4: Lên men lactic dị hình : 1. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 2. Phosphogluconat-dedihydrogenase 3. Epimerase ; 4. Phosphoketolase 4. ứng dụng của lên men lactic Nếu để dung dịch đường không khử trùng chứa cả các nguồn nitơ phức tạp và các chất sinh trưởng một cách tự nhiên trong trong điều kiện kị khí hoặc dưới dạng lớp cao thì các vi khuẩn lactic sẽ nhanh chóng phát triển ở phía bên trong. Chúng làm giảm pH xuống dưới 5 và qua đó ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn kị khí khác là bọn không có khả năng sinh trưởng ở độ chua này. Trong các môi trường làm giàu này nhóm vi khuẩn nào phát triển được là tuỳ thuộc vào các điều kiện đặc biệt. Nhờ đặc tính bảo quản và khử trùng dựa trên nguyên tắc acid hóa mà các vi khuẩn lactic được sử dụng, trong nông nghiệp, trong nội trợ, trong ngành sản xuất và chế biến sữa. 4.1.Thức ăn ủ chua. Vi khuẩn lactic phân bố trên các nguyên liệu thực vật giữ một vai trò to lớn trong việc bảo quản thức ăn gia súc. Để tạo điều kiện cho lên men lactic xảy ra, lá các loại cây lấy củ hoặc cỏ ... được nén chặt trong các hầm ủ, thêm rỉ đường để nâng cao tỉ lệ C/N và tạo độ chua ban đầu bằng cách thêm acid formic hay acid vô cơ. 4.2.Dưa là một sản phẩm của quá trình lên men lactic. Bắp cải được cắt nhỏ, trộn và bóp với muối ăn 2-3%. Trong điều kiện yếm khí, lên men lactic sẽ xảy ra một cách tự nhiên, lúc đầu bởi Leuconostoc - với sự tạo thành CO 2 , và về sau có sự tham gia của Lactobacillus plantarum. 4.3.Các sản phẩm sữa. Sữa có một thành phần dinh dưỡng cao, chứa nhiều nước và giàu các muối khoáng, protein (chủ yếu là cazein), mỡ bơ, đường (đặc biệt là lactose) và các vitamin. Ở trong bầu vú của động vật thì nó là vô trùng, nhưng khi đi ra khỏi núm vú thì sữa bị nhiễm bởi khu hệ bình thường của động vật, sau đó được bổ sung thêm bởi các vi sinh vật khác từ người vắt sữa, máy hoặc bình chứa. Là một môi trường gần như hoàn hảo nên sữa rất mẫn cảm với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Khi để sữa ở trong phòng nhiều loại vi khuẩn sẽ lên men lactose tạo thành acid và làm thay đổi tính chất và kiến trúc của sữa. Quá trình này có thể xảy ra tự nhiên hoặc được con người bắt chước như trong qnầ trình sản xuất phomat hoặc iagua. Trong các giai đoạn sớm của lên men sữa lactose bị tấn công nhanh bởi Streptococcus lactis và Lactobacillus spp. Sự tiết acid lactic và sự giảm pH làm protein của sữa bị đông lại thành cục vón (curd). Sự đông cũng làm tách riêng phần dịch đường sữa (whey) ở trên bề mặt. Cục vón cũng có thể được tạo nên nhờ tác dụng của vi sinh vật hoặc nhờ một enzyme (rennin) lấy từ dạ dày bê. Một lít sữa nặng 1032g bao gồm 902g nước và 130g chất khô trong đó chứa 49g lactose; 39g chất béo (là những giọt mỡ đường kính 1-8 μm gồm glixerit và các chất tan trong lipit, như colesterol và các vitamin A, D, E, K; 32,7g protein mà chủ yếu là cazein; 9g chất khoáng (gồm phosphate, xitrat, KCl, NaCl và MgCl 2 ). *Sữa chua (sữa bơ). Sữa chua là sản phẩm của sự lên men sữa lỏng bằng sự để chua ngẫu nhiên dưới tác động của nhiều vi khuẩn sinh acid lactic khác nhau (như Streptococcus lactis hay S. cremoris), hoặc của một số lượng ít hơn nhiều các vi khuẩn gây thơm (như Streptococcus diacetylacis, etacoccus citrovorus) hoặc bằng việc cấy vào sữa đã đun nóng các giống vi khuẩn thuần khiết. Khi lên men diễn ra, lactose được chuyển hoá thành acid lactic, acid này sẽ ngưng kết cazein ở pH 4-5. Sữa đông, đặc, có vị chua, tùy theo vùng có tên gọi khác nhau. Sữa chua được làm từ sữa đầy đủ (chứa ít nhất 3% mỡ của sữa) thường được trộn với bột sữa đã vớt váng nhằm làm tăng hàm lượng chất rắn toàn phần và cải thiện cấu trúc gel protein. ở một số nước, sữa chua cũng được sản xuất từ sữa cừu, sữa trâu, sữa tuần lộc hoặc sữa ngựa. Kem chua được sản xuất bởi một quá trình rất giống quy trình dùng để sản xuất sữa chua chỉ trừ việc kem cà phê đã được sử dụng làm nguyên liệu thô. *Iagua. Iagua được làm từ các loại sữa chứa các hàm lượng mỡ khác nhau bằng cách lên men nhờ các giống đặc biệt. Nó có một độ đông đặc mịn giống như gel, một độ chua rõ rệt và hương vị dễ chịu, khác biệt rõ ràng với loại sữa chua bình thường. Iagua được sản xuất bằng cách cấy vào sữa đã khử trùng Pasteur đồng nhất khoảng 1,5-3% các vi khuẩn lactic ưa nhiệt (giống hỗn hợp của một hoặc nhiều chủng như Streptococcus thermophilus hay Lactobacillus bulgaricus) và sau đó giữ ở 42-45 o C trong khoảng 3 giờ. Độ quánh mịn được hình thành trong thời gian này. Sản phẩm cuối cùng có vị chua (độ chua 40-60 o SH). Phần quan trọng trong hương thơm đặc biệt của iagua là các hợp chất cacbonyl với đixetyl và acetaldehit chiếm ưu thế. Một loại igua đặc biệt có tên là sữa aciđophilus được sản xuất nhờ Lactobacillus acidophilú. Việc thêm đường và hoa quả vào iagua (iagua hoa quả) làm tăng đáng kể sức tiêu thụ sản phẩm này. *Kefia và Kumis. Kefia và Kumis là các loại đồ uống chứa rượu giàu CO 2 , nhiều bọt. Khu hệ vi sinh vật bao gồm nấm men Torula (chịu trách nhiệm đối với quá trình lên men rượu) và các vi khuẩn Streptococcus lactis và Lactobacillus caucaticus (chịu trách nhiệm đối với lên men lactic). Các hạt kefia dùng để sản xuất kefia chứa các cục sữa đông cộng với các vi khuẩn kefia. Kumis được làm từ sữa ngựa hay sữa dê do các giống kumis thuần khiết (Thermobacterrium bulgaricus và nấm men Candida) . Cả hai đồ uống làm từ sữa này đều là các sản phẩm địa phương của vùng Caucasus và các vùng thảo nguyên Turkestan. Kefia chứa acid lactic (0,5- 1%), một số lượng rượu đáng kể (0,5-2%), CO 2 và một số sản phẩm phân giải cazein sinh ra từ hoạt động phân giải protein của nấm men. *Phomat. Phomat là sản phẩm thu được từ sữa đông bằng cách loại bỏ dịch đường sữa và bằng cách làm chín cục vón khi có mặt một khu hệ vi sinh vật đặc biệt. Có nhiều loại phomat với hình dạng và kích thước khác nhau. được xếp thành nhóm dựa vào loại sữa sử dụng (bò, dê, cừu), sự tạo thành cục vón (dùng acid, dùng rennin hay dùng cả hai), kiến trúc hay độ đặc, và hàm lượng chất béo. Trong từng nhóm, các loại phomat riêng biệt được đặc trưng bởi hương thơm. Sự sản xuất phomat về cơ bản bao gồm hai công đoạn : sự tạo thành cục vón và quá trình làm chín. *Sự tạo thành cục vón Hàm lượng chất béo của sữa được điều chỉnh tới mức độ mong mnốn, và khi cần, hàm lượng protein cũng được điều chỉnh. Các chất phụ gia bao gồm muối canxi nhằm cải thiện sự ngưng kết protein và kiến trúc của phomat, nitrat để kìm hãm khu hệ vi khuẩn kị khí hình thành bào tử và các sắc tố tạo màu. Sữa thô hoặc sữa đã khử trùng được trộn trong một bể ở nhiệt độ 15- 59 o C với một loại giống khởi động (vi khuẩn lactic hay vi khuẩn propionic, nấm sợi, như Penicillium camemberti, P. candidum, P. roqueforti , các vi khuẩn mang sắc tố màu vàng hoặc màu đỏ như Bacterium linens, cùng các cầu khuẩn và nấm men) và sữa sẽ đông lại thành một khối bán lỏng mềm, cụcvón, sau lên men lactic, được nối tiếp bằng sự bổ sung rennin hoặc một tổ hợp nào đó mà thông thường nhất là tổ hợp giữa acid và rennin. Gel protein này sẽ được cắt thành các hình khối nhỏ trong lúc đang được đun nóng rồi sau đó được khuấy nhẹ. Dịch đường sữa được loại bỏ còn phần cục vón chứa mỡ thì được chuyển sang quá trình làm rắn. Khi độ rắn mong muốn đã đạt được, cục vón được chuyển sang quá trình làm chín. *Làm chín Quá trình làm chín phụ thuộc vào thành phần khối phomat, đặc biệt là hàm lượng nước, khu hệ vi sinh vật và các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ và độ ẩm của các phòng làm chín. Sự chín của phomat mềm xảy ra từ ngoài vào trong, vì thế trong giai đoạn đầu sẽ có một phần vỏ chín và một phần lõi chưa chín. Sự chín không đồng đều xảy ra là do có sự chênh lệch về pH. ở bên trong khối phomat, pH thấp vì có mặt acid lactic. ở ngoài vỏ, các loài nấm sợi đặc trưng phát triển thích hợp hơn ở các pH cao đã nâng pH lên nhờ phản ứng loại CO 2 từ các amino acid. Sự chín ở phomat cứng xảy ra đồng đều trên toàn bộ khối phomat. Sự tạo thành vỏ chỉ là kết quả của sự khô bề mặt, điều này có thể tránh được nhờ việc bao gói khối phomat trong các màng plastic thích hợp trước khi quá trình làm chín bắt đầu. Thời gian làm chín thay đổi tùy trường hợp, kéo dài từ vài ngày đối với phomat mềm tới vài tháng thậm chí vài năm đối với các loại phomat cứng. Sản lượng trên 100 kg sữa nước là 8 kg phomat cứng và tới 12 kg phomat mềm. Mọi thành phần của phomat đều chịu sự biến đổi về mặt sinh hoá học ở các mức độ khác nhau trong quá trình làm chín. Lactose được phân giải thành acid lactic nhờ lên men lactic đồng hình. Trong loại phomat cheđa chẳng hạn, pH giảm từ 6,55 xuống 5,15 tính từ lúc bổ sung giống khởi động cho tới khi đúc thành khuôn. Khi có mặt vi khuẩn propionic (như trong trường hợp của phomat Emmental), acid lactic được chuyển hóa tiếp tục thành acid propionic, acid acetic, và CO 2 theo phản ứng : 3 CH 3 CHOHCOOH → 2 CH 3 CH 2 COOH + CH 3 COOH + CO 2 + H 2 O Tỉ lệ giữa acid propionic và acid acetic bị ảnh hưởng bởi thế oxi hóa khử của phomat và tỉ lệ này sẽ thấp khi có mặt muối nitrat chăng hạn. Phương thức và mức độ phân giải mỡ của sữa phụ thuộc vào khu hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình làm chín phomat. Sự giải phóng các acid béo, đặc biệt là các acid ảnh hương đến hương thơm của phomat phụ thuộc vào tính đặc hiệu của các lipase. Ngoài các acid béo tự do, 2-alkanon và 2-alkanol cũng được tạo thành như các sản phẩm phụ của sự β-oxi hoá các acid béo. Nấm sợi, đặc biệt là Penicillium roqueorti, sử dụng β-ketoaxyl-CoA đeaxylase (tiodihydroase) và β-ketoacid đecacboxylase để cung cấp các hợp chất điển hình cho hương thơm của các phomat bán mềm. Sự phân giải protein thành các amino acid xảy ra qua các peptit như ìà các sản phẩm trung gian. Tùy thuộc vào loại sữa mà 20-40% cazein được chuyển hoá thành các dẫn xuất protein hòa tan trong đó 5-15% là các acid amin. Phạm vi pH 3-6 là tối ưu đối với hoạt tính proteinase của Penicillium roqueorti. Sự phân giải protein bị ảnh hưởng mạnh bởi hàm lượng muối chứa trong phomat. Hàm lượng amino acid là 2,6-9% phần chất rắn của phomat và là phần quan trọng trong hương thơm của phomat. Những lỗi trong quá trình làm chín có thể tạo nên những peptit có vị đắng. Các amino acid được chuyển hóa tiếp tục. Trong giai đoạn sớm của sự làm chín, với pH thấp, chúng bị loại CO 2 thành các amino. Trong giai đoạn muộn, với pH cao, các phản ứng oxi hoá chiếm ưu thế. Sự phân giải protein không chỉ đóng góp vào sự tạo thành hương thơm, nó còn ảnh hưởng đến kiến trúc của phomat. Khi phomat mềm bị làm chín quá mức, sự phân giải protein có thể dẫn đến việc dịch hóa gần như toàn bộ khối phomat. Câu hỏi ôn tập chương 8 1. Trong tế bào, quá trình đường phân diễn ra ở đâu ? Phản ứng này khác nhau như thế nào khi không có mặt oxy và khi có mặt oxy ? 2. Phân tử nào mở đầu con đường đường phân ? Khi đường phân hoàn thành, phân tử nào còn lại. Bao nhiêu ATP được tạo thành ở mức độ phosphoril hóa cơ chất ? Con số ATP được tạo thành là bao nhiêu, và vì sao con số này lại khác với tổng số ATP được tạo thành ? Bao nhiêu ATP sẽ được tạo thành bổ sung nếu oxy có mặt ? 3. Khi nguông glucose là không hạn chế thì cái gì sẽ là nhân tố giới hạn trong phản ứng đường phân ? 4. Hai cơ chế tái tạo NAD + là những cơ chế nào ? Chúng khác nhau ở chỗ nào ? Đâu là một quá trình hiếu khí và đâu là một quá trình kị khí ? 5. Lên men khác hô hấp oxy hóa chỗ nào khi xét về phương diện các chất nhận điện tử và sự sản sinh năng lượng ? 6. Sự trao đổi điện tử để tạo nên ATP khác nhau như thế nào trong các trường hợp NADH được tạo thành trong đường phân, NADH được tạo thành trong chu trình acid citric, và FADH 2 được tạo thành trong chu trình acid citric ? 7. Hiệu quả của việc phân giải hiếu khí hoàn toàn một phân tử glucose ở vi khuẩn là bao nhiêu ? So sánh với hiệu quả của một mình đường phân? 8. Hiệu ứng Pasteur có gặp ở các vi khuẩn lên men lactic đồng hình không ? Vì sao ? 9. Giải thích tại sao ở một số nấm men, như Rhodotorula hay Geotrichum, khi thừa nguồn C, đồng thời thiếu N và P thì lipit lại được tích lũy ? 10. Cho ví dụ về những trường hợp lên men ở vi khuẩn trong đó có sự tạo thành nhiều hơn 2 mol ATP trên một mol glucose bị phân hủy.