Chương 8 Các quá trình lên men(Phần 3)

Chương 8 Các quá trình lên men (Phần 3) IV. Hiện tượng cộng dưỡng (syntrophy) Trong vi sinh vật học có nhiều ví dụ về hiện tượng cộng dưỡng, một hiện tượng mà hai sinh vật khác nhau có thể cùng nhau phân giải một chất nào đó - và bảo toàn năng lượng của quá trình phân giải đến mức không cơ thể nào trong hai cơ thể đó một mình có thể làm được. Trong đa số trường hợp, bản chất của một phản ứng cộng dưỡng có liên quan tới khí dihydro (H 2 ) sinh ra bởi một trong hai đối tác và được tiêu thụ bởi đối tác kia. Do vậy, cho đến nay, cộng dưỡng cũng còn được gọi là sự chuyển H 2 liên loài. Kẻ tiêu thụ H 2 có thể là bất kỳ một cơ thể nào trong số các vi khuẩn khử sunfat, lên men homoacetate, và vi khuẩn sinh methane. Hãy xem xét trường hợp cộng dưỡng liên quan tới quá trình lên men ethanol thành acetate và sự sản sinh methane sau đó. Như có thể thấy trên hình 2, bọn lên men ethanol thực hiện một phản ứng không thuận lợi về mặt năng lượng tự do (ΔG o' dương). Tuy nhiên, H 2 được sinh ra bởi đối tác lên men rượu lại là một chất cho điện tử đầy giá trị đối với quá trình hình thành methane do một vi khuẩn sinh methane thực hiện. Và khi cộng hai phản ứng lại thì phản ứng tổng thể sẽ là một phản ứng toả nhiệt và có thể trợ giúp sinh trưởng của cả hai đối tác trong hỗn hợp cộng dưỡng. Lên men ethanol 2CH 3 CH 2 OH + 2H 2 O → 4H 2 + 2CH 3 COO - +2H + +19,4 kJ /phản ứng Sinh methane 4H 2 + CO 2 → CH 4 + 2H 2 O - 130,7 kJ/phản ứng Phản ứng cộng dưỡng 2CH 3 CH 2 OH + CO 2 → CH 4 + 2CH 3 COO - - 111,3 kJ/phản ứng Một ví dụ khác của hiện tượng cộng dưỡng là sự oxi hóa butirat thành acetate cộng với H 2 bởi vi khuẩn cộng dưỡng oxi hóa acid béo Syntrophomonas: Butirat - + 2H 2 O → 2acetate - + H + + 2H 2 , ΔG o' = +48,2 kJ/phản ứng Sự biến đổi năng lượng tự do của phản ứng này rất không thuận lợi và trong ống giống thuần khiết, Syntrophomonas không thể mọc được trên butirat. Song nếu H 2 vừa sinh ra trong phản ứng được tiêu thụ ngay bởi một cơ thể đối tác (như một vi khuẩn sinh methane) thì Syntrophomonas lại sinh trưởng rất tốt trong ống giống cấy chung với bọn tiêu thụ H 2 . V. Lên men rượu nhờ nấm men và vi khuẩn Ethanol là một trong số các sản phẩm lên men phổ biến nhất gặp ở vi sinh vật. Bản thân thực vật và nhiều loài nấm cũng tích lũy ethanol dưới các điều kiện kị khí. Vi sinh vật sản sinh ethanol chủ yếu là nấm men, đặc biệt là các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. Giống như đa số nấm, nấm men là những cơ thể hô hấp hiếu khí, nhưng khi vắng mặt không khí chúng sẽ lên men hiđrat cacbon thành ethanol và CO 2 . Nhiều vi khuẩn kị khí và hiếu khí cũng tạo thành ethanol như các sản phẩm chính hoặc sản phẩm phụ khi lên men các hexose hoặc pentose. 1. Sự tạo thành ethanol nhờ nấm men Sự lên men glucose thành ethanol và CO 2 nhờ Saccharomyces cerevisiae diễn ra theo con đường Embden-Meyerhof. Sự chuyển hóa piruvat thành ethanol gồm hai bước. Trong bước một, piruvat được loại CO 2 thành acetaldehit nhờ piruvat-đecacboxilase với sự tham gia của tiaminpirophosphate. Trong bước sau, acetaldehit bị khử thành ethanol nhờ alcohol-đedihydrogenase chứa NADH. 2Et 2CO2 2NAD2NADH 2 Piruvat 2 Acetaldehyt Glucose Bằng sự chuyền H này, dihydro tách ra do triosephosphate- dehydrogenase xúc tác sẽ được tiêu thụ, nhờ vậy trạng thái oxi hóa-khử sẽ được cân bằng. 2. Các dạng phương trình Neuberg Các phương pháp và phát hiện của Carl Neuberg về lên men rượu không chỉ có ý nghĩa lịch sử. Ông đã khám phá ra rằng, không chỉ glucose mà cả piruvat cũng được nấm men lên men và acetaldehit xuất hiện như một sản phẩm trung gian có thể bị bắt giữ bởi dihydrosulfit. Dihydrosulfit vốn không độc đối với nấm men. Nếu bổ sung dihydrosulfit vào một môi trường chứa glucose đang được nấm men lên men thì acetaldehit sẽ bị kết tủa do tạo thành phức chất : CH 3 -CHO + NaHSO 3 → CH 3 - CHOH -SO 3 Na Lúc đó glycerin sẽ xuất hiện như một sản phẩm lên men mới, đồng thời hiệu suất ethanol và CO 2 sẽ giảm xuống. Lên men với sự có mặt của dihydrosulfit đã được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất glycerin. Nguyên lý của nó là, acetaldehit bị bắt giữ, và do vậy không thể hoạt động như một chất nhận điện tử được nữa. Lúc này, thay cho acetaldehit, dihydroxiacetonphosphate được sử dụng làm chất nhận điện tử và bị khử thành glycerin-3-phosphate rồi tiếp tục bị loại phosphate để trở thành glycerin. Phương trình phản ứng diễn ra như sau : Glucose + Dihydrosulfit → Glycerin + Acetaldehit-sulfit + CO 2 Phương trình lên men cải biến này được gọi là dạng lên men Neuberg 2. Khi bổ sung các chất kiềm (NaHCO 3 , Na 2 HPO 4 ) thì glycerin cũng được tạo thành vì acetaldehit bị chuyển thành ethanol và acetate qua phản ứng hóa hai, và do vậy không còn hoàn thành được chức năng của một chất nhận điện tử. Phương trình lên men có tên là dạng lên men Neuberg 3 và được viết như sau : Glucose + 2H 2 O → Ethanol + Acetate + 2Glycerin + 2CO 2 Dạng lên men thông thường được Neuberg gọi là dạng lên men 1. 3. Hiệu ứng Pasteur Hiệu ứng Pasteur là sự ức chế lên men rượu (hay quá trình đường phân) bởi oxi (tức là bởi hô hấp hiếu khí). Sự chuyển sang hô hấp không những làm giảm sự tạo thành ethanol và CO 2 mà còn làm giảm sự hấp thụ đường. Có hai cơ chế chịu trách nhiệm đối với hiện tượng này. Một mặt, đó là sự cạnh tranh ADP và phosphate vô cơ giữa hai quá trình phosphorin chuỗi hô hấp và phosphorin hóa cơ chất. Sự loại dihydro xảy ra trong phản ứng oxi hóa glyceraldehyt-3-phosphate cần ADP và phosphate vô cơ (P vc ) : Glyceraldehyt-3-phosphate + NAD + P vc → 3-phosphoglicerate + NAD H + ATP Do vậy, sự chuyển hóa cơ chất (glucose) qua con đường EM phụ thuộc vào sự có mặt của ADP và phosphate. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sự phosphorin hóa chuỗi hô hấp cũng cạnh tranh ADP và phosphate để phát sinh ATP. Lúc đó nồng độ nội bào của ADP và phosphate giảm, và hậu quả là, sự chuyển hóa glucose và do vậy, sự tạo thành ethanol cũng sẽ giảm. Khi dùng đinitrophenol (DNP) để làm bất hoạt phosphorin hóa chuỗi hô hấp, ADP và phosphate lại trở nên có sẵn đối với phản ứng loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate, bởi vậy người ta thấy ngay trong điều kiện thóang khí, sự tiêu thụ glucose (cho lên men) vẫn tăng. Cơ chế thứ hai chịu trách nhiệm đối với hiệu ứng Pasteur là cơ chế điều hoà bằng enzyme dị lập thể. Hình 3 tóm tắt những quan hệ điều hòa chủ chốt trong hiệu ứng này. Trong điều kiện thoáng khí, sự lên men rượu chỉ tạo thành một vài ATP tính trên mỗi phân tử glucose. Để duy trì sự cung cấp năng lượng, tế bào phải sử dụng nhiều glucose. Tỉ lệ của ATP/AMP trong trường hợp này rất thấp. Trái lại, khi oxi xâm nhập vào môi trường, ATP được tạo thêm rất nhiều nhờ sự quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp. Enzyme chìa khóa dị lập thể điều hòa sự sử dụng glucose trong nấm men lên men rượu là phosphofructokinase. Đó là enzyme không thuận nghịch đầu tiên của con đường EM. Nó xúc tác cho sự phosphorin hóa fructose-6- phosphate thành fructose-1,6-điphophat nhờ ATP và bị kìm hãm dị lập thể bởi ATP. Sự kìm hãm theo cơ chế liên kết ngược này làm tăng nồng độ glucose-6-phosphate trong tế bào do tính thuận nghịch của phản ứng enzyme trước đó. Glucose-6-phosphate kìm hãm dị lập thể hexokinase, kìm hãm cả sự hấp thu glucose, do đó làm giảm sự tiêu thụ đường này. Trong khi ATP kìm hãm dị lập thể phosphofructokinase thì AMP lại hoạt hóa nó. Bởi vậy một tỉ lệ ATP/AMP thấp như trong lên men lại kích thích sự hấp thu và sự trao đổi glucose. Hoạt tính của phosphofructokinase cũng bị kìm hãm bởi xitrat. Nhờ chất hiệu ứng âm tính thứ hai này mà tác dụng kìm hãm của ATP được tăng cường, trái lại các ion amôn lại kích thích enzyme này. Sự điều hòa mô tả ở trên có thể được chứng minh dễ dàng khi người ta đo nồng độ nội bào của glucose, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate trước và sau khi chuyển từ điều kiện nuôi kị khí sang điều kiện nuôi hiếu khí. Ngay sau khi được thông khí, nồng độ glucose-6-phosphate và fructose-6-P của tế bào tăng nhanh, còn nồng độ của fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate lại giảm mạnh. ở đây, phosphofructosekinase hoạt động như một cái van được điều chỉnh bởi các ađenilat cũng như các chất trao đỗi trung gian khác. Nếu van bị đóng, các chất trao đổi nằm phía trên van sẽ bị ứ đọng, còn các chất nằm bên dưới van được tiếp tục chuyển hóa và do vậy, nồng độ giảm đi. Hiệu ứng Pasteur cũng gặp ở vi khuẩn (chẳng hạn, ở E. coli) và ở mô động vật. Nguyên tắc điều hòa là giống nhau, chỉ có những khác biệt về loại chất hiệu ứng. Chẳng hạn, ở E. coli, không phải AMP mà ADP mới là chất hiệu ứng dương. Những cơ chế cơ bản của trao đỗi chất thì rất giống nhau, còn các cơ chế điều hòa thì thường có tính đặc hiệu loài và đặc hiệu chủng. 4.Kỹ thuật sản xuất ethanol nhờ nấm men Các loài nấm men dùng trong sản xuất ethanol là các nấm đơn bào mang nhiều đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển. Các loài được quan tâm trước hết trong sản xuất công nghiệp là Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum (carslbergensis), Schizosaccharomyces pombe và Kluyveromyces sp. Ngoài ra, nhiều biến chủng bắt nguồn từ các nấm men này đã được tạo ra nhờ kỹ thuật di truyền. Các tính chất mong muốn của một quá trình sản xuất ethanol công nghiệp phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn chủng vi sinh vật dùng trong lên men. Các chủng này phải có một năng suất sản phẩm cao trên một đơn vị cơ chất được sử dụng, một tốc độ lên men cao, tính chịu cồn cần thiết, khả năng sống sót ở nhiệt độ cao, tính bền trong các điều kiện lên men và tính chịu pH thấp. Khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau phụ thuộc vào loài. Nói chung, các cơ thể này có khả năng sinh trưởng và lên men ethanol có hiệu quả ở các giá trị pH giữa 3,5-6,0 và nhiệt độ từ 28-35 o C. Hiện nay người ta quan tâm nhiều đến việc tạo ra các thể đột biến khuyết hô hấp từ nấm men nhờ việc sử dụng các tác nhân hóa học như các thuốc nhuộm hoặc các hợp chất làm biến tính protein. Các biến chủng này chứa ADN ti thể đã bị biến đổi theo hướng ức chế sự tạo ra các enzyme cần thiết cho sự trao đổi chất hiếu khí và do vậy thích hợp với sự tổng hợp rượu. 5. Hiệu suất lên men Nấm men, dưới điều kiện kị khí chuyển hoá glucose thành ethanol trước hết bằng con đường Embden-Meyerhof. Phản ứng thật sứ bao gồm sự tạo thành 2 mol ethanol, 2 mol CO 2 và 2 mol ATP trên mỗi mol glucose được lên men. Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucose về lý thuyết có thể tạo ra 0,51 g rượu. Tuy nhiên sản lượng đạt được trong lên men thực tế thường không vượt quá 90-95% con số lý thuyết. Sở dĩ như vậy là vì một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối mới và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào. Cũng còn có các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới Glycerin và sucxinat) tiêu thụ tới 4-5% cơ chất tổng số. Nếu loại trừ được các phản ứng này thì sản lượng ethanol có thể tăng thêm được 2,7%. Một nồng độ nhỏ oxi cần phải được cung cấp cho nấm men lên men vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa bão hòa và các lipit. Thông thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05-0,1 mm Hg tính theo áp suất oxi. Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó đều sẽ kích thích sinh trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol (hiệu ứng Pasteur). Các nhu cầu tương đối của các chất dinh dưỡng được dùng trong sự tổng hợp ethanol tỉ lệ thuận với các thành phần chính của tế bào nấm men. Chúng bao gồm C, O, N, và H. Thấp hơn một chút là P, S, K và Mg dùng để tổng hợp các thành phần thứ yếu. Các muối vô cơ (như Mn, Co, Cu, Zn) và các nhân tố sinh trưởng hữu cơ (acid amin, acid nucleic, và các vitamin) được yêu cấu dưới dạng vết. Nhiều loại nguyên liệu dùng để sản xuất rượu ở quy mô lớn (như rỉ đường mía hay actiso Jerusalem) ngoài hiđrat C còn cung cấp toàn bộ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của nấm men. Trong một số trường hợp, người ta cũng đưa thêm vào một số chất dinh dưỡng bổ sung như các muối amôn, phosphate K hay nguồn cao ngô rẻ tiền. Cơ chế điều hòa nhờ enzyme dị lập thể Phosphofructosekinase Nấm men rất mẫn cảm với sự ức chế bởi ethanol. Nồng độ 1-2% (w/v) đã đủ để làm chậm sinh trưởng của vi sinh vật và ở nồng độ cồn 10% (w/v) tốc độ sinh trưởng của nấm men gần như ngừng hẳn. Bản chất của hiện tượng kìm hãm này là rất phức tạp. Việc thêm cồn vào pha log làm giảm nhanh tốc độ sinh trưởng của nấm men (có lẽ do tác động lên sự tổng hợp protein), giảm khả năng sống sót của tế bào (qua sự biến tính không thuận nghịch của các enzyme), và ở một mức độ thấp hơn nhiều, ethanol làm giảm tóc độ tổng hợp bản thân nó. Các dẫn liệu về mức độ chịu cồn của một số chủng nấm men phụ thuộc rất nhiều vào thành phần acid béo trong màng tế bào chất cho thấy rằng thành phần acid béo kích thích hoặc kìm hãm sự tiết ethanol khỏi bào tương. Các kết quả khác cung chứng minh được rằng ethanol được tạo ra trong lên men (ethanol tự sinh) ức chế lên sinh trưởng của tế bào mạnh hơn là ethanol được đưa vào một cách nhân tạo từ bên ngoài. 6. Sự tạo thành ethanol nhờ vi khuẩn Trong số vi khuẩn, kiểu lên men rượu phổ biến ở nấm men (EM, piruvat- đecacboxilase) chỉ gặp ở Sarcina ventriculi. Đây là loài vi khuẩn chịu khí yếu, dễ dàng phân lập được từ đất, nhưng cũng gặp cả trong dịch tiêu hóa của những người mắc bệnh dạ dày. Các vi khuẩn này được coi là không bình thường vì có kích thước rất lớn (đường kính 4 μm), tạo nên các dạng hộp bao gói (chứa trên 64 tế bào mỗi hộp , được liên kết với nhau nhờ xenlulose), chịu pH (sinh trưởng được ở pH từ 0,9 đến 9,8) và tạo thành nội bào tử. Từ dịch ép lên men của cây dứa dại (Agave americana) ở vùng Mexico người ta đã phân lập được một loài vi khuẩn hình que, di động, có lông roi ở hai cực, có khả năng tạo thành ethanol. Vi khuẩn này có tên là Zymomonas mobilis, phân giải glucose theo con đường 2-keto-3deoxi-6-phosphogluconat (KDPG) cắt piruvat thành acetaldehit và đioxit cacbon. Acetaldehit được khử thành ethanol. Ethanol, đioxit cacbon và một lượng nhỏ acid lactic là những sản phẩm lên men duy nhất. Người ta để ý rằng trong rượu mạnh chế từ dứa dại, các nguyên tử cacbon số 2 và số 3 cũng như số 5 và số 6 đã thay thế các nguyên tử cacbon số 1 và số 2 cũng như số 5 và số 6 trong rượu chế từ nấm men. Trong quá trình lên men của một số Enterobacteriaceae và Clostridium, ethanol xuất hiện như một sản phẩm phụ. Tuy nhiên, tiền chất của ethanol, acetaldehit, không được giải phóng trực tiếp từ piruvat nhờ piruvatđecacboxilase mà được tạo thành nhờ sự khử acetil-CoA. Các vi khuẩn lên men lactic dị hình (ví dụ Leuconostoc mesenteroides) tạo ra alcohol theo một con đường hoàn toàn khác. Qua các bước đầu tiên của con đường pentosephosphate (PP), glucose được phân giải thành pentosephosphate. Phosphoketolase tấn công vào xilulose -5- phosphate : Xilulose-5-phosphate+P vc → Acetilphosphate + glyceraldehyt-3-phosphate Acetilphosphate vừa tạo thành nhờ acetaldehit-đedihydrogenase và alcohol- đedihydrogenase sẽ được khử thành ethanol. Sản phẩm phân giải còn lại là glyceraldehyt-3-phosphate, sẽ được khử thành lactat qua piruvat.