Chế phẩm sinh học dùng trong thực phẩm - Protease

ProteaseCHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỰC PHẨM I. Tổng quát về protease vi sinh vậtNhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease, có thể là protease ngoại bào hay nội bào. Protease được thu nhận từ vi sinh vật rất đa dạng và phong phú:- Aspergillopepsin: Aspergillus oryzae, A.niger- Mucorpepsin (Mucor rennin): Rhizomucor miehei, R.pusillus- Saccharopepsin: Saccharomyces cerevisae - Bacillolysin: Bacillus subtilis- Subtilysin: Bacillus amyloliquafaciens1. Tính chấtProtease vi sinh vật có ưu điểm là hoạt động được trong khoảng pH khá rộng, chúng tổng hợp được cả hai loại enzyme endopeptidase và exopeptidase, do vậy thủy phân được đến 80% lên kết peptid của protein.Protease của vi khuẩn hoạt động trong vùng pH hẹp hơn (pH 7-8) so với protease nấm mốc (pH 2-11). Điểm đặc biệt quan trọng để phân biệt các protease là pH tối ưu. Protease trên thị trường gồm 3 loại là protease kiềm tính, protease trung tính và protease acid tính. * Protease kiềm tính:Nhiều chủng vi sinh vật tiết protease kiềm tính ngoại bào quan trọng như chủng vi khuẩn Bacillus: B.licheniformis, B.pumillus..., nấm mốc như chủng Aspergillus: A,niger, A.sozae..., protease kiềm tính được tiết nhiều nhất là Subtilisin BPN và Subtilisin Novo sản xuất từ vi khuẩn B.amyloliquafaciens với các đặc tính như chịu nhiệt cao vào khoảng 700C, bền vững trong môi trường kiềm pH vào khoảng 9-11.* Protease trung tính:Các chủng vi sinh vật có khả năng tiết protease trung tính ngoại bào như vi khuẩn B.substilis, B.sereus...., nấm mốc A.oryzae, A.sozae ... Protease trung tính có khoảng pHopt rất hẹp, không bền với nhiệt độ cao và mất hoạt tính khi có sự hiện diện của protease kiềm.* Protease acid tính:Protease acid tính hay còn được gọi là aspartic protease, được ứng dụng nhiều trong kỹ nghệ fromage, dược và thực phẩm. Khoảng pHopt từ 2-4. Các vi sinh vật có khả năng tiết protease acid tính gồm có Mucor pusillus, M.miehei, Penicillium janthinellum, P.roqueforti, A.oryzae, Pseudomonas sp. ...2. Protease vi khuẩnProtease của vi khuẩn được chia thành hai loại: Protease trung tính và protease kiềm. Một số tính chất của protease từ vi khuẩnTính chấtProtease kiềm của vi khuẩnProtease trung tính của vi khuẩnpH hoạt động7 – 116 – 9pH tối thích7,5 – 9,56 – 8Tác nhân ức chếDIFP, PMSFEDTA, sodium, dodecyl sulfatCơ chất đặc trưngEster, amide, peptidPeptid và esterDIFP: diisopropyl fluorophosphatPMSF: phenylmethanesulfonyl fluorideEDTA: ethylenediaminetetraacetic acid3. Protease nấm mốcProtease nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease vi khuẩn. Protease nấm mốc có thể chia thành hai loại: Protease acid, protesae trung tính và protease kiềm.Một số tính chất của protease từ nấm mốcVi sinh vậtpH thích hợppH ổn địnhChất ức chếCơ chất hemoglobinCơ chất caseinAsp. Saitoi3-4,52,5-32-5NBSAsp.oryzae (protease acid)3-42,5-35Asp.oryzae (protease trung tính)5,5-7,57EDTAAsp.oryzae (protease kiềm)6-9,56,5-107-8DIFPPacilomyces varioti3,5-5,533-5Rhizopus chinensis52,9-3,33,8-6,5Mucor pusillus3,5-4,55,63-6NBS: N-bromosuccinide Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành protease của nấm mốc- Nhiệt độ:Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc và khả năng tổng hợp enzyme của chúng cũng như tính chất của enzyme. Hầu hết nấm mốc phát triển thích hợp ở nhiệt độ 22-320C. Ở một số loài nấm như Asp.cardidus hay Mucor sp. Renninus khi tăng nhiệt độ đến 360C sẽ làm mất hoàn toàn hoặc giảm khả năng đông tụ sữa của enzyme. Nhiệt độ càng cao sẽ dễ làm hỏng cấu trúc enzyme, gây mất hoặc giảm hoạt tính xúc tác của enzyme. Hiệu suất tổng hợp protease của chủng Aspergillus tăng khi giảm nhiệt độ nuôi cấy từ 30 – 320C xuống 22-240C. - Độ ẩm mơi trường:Khi nuơi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt, độ ẩm là một trong những yếu tố rất cần thiết cho sự sinh sản của nấm mốc. Khi độ ẩm của mơi trường thấp thì hệ sợi của nấm mốc mọc yếu, kém sinh bào tử, thời gian sinh trưởng nấm mốc bị hạn chế, ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme của nấm mốc.Độ ẩm thích hợp để thu canh trường của nấm mốc cĩ hàm lượng enzyme cao là 53 – 70%, phụ thuộc vào tính chất sinh l‎ý của chủng giống, cấu trúc cơ học của mơi trường và điều kiện nuơi cấy.- Thời gian nuôi cấy:Khi nuôi cấy nấm mốc Aspergillus bằng phương pháp bề mặt, nhiều tác giả ghi nhận rằng thời gian nuôi cấy nấm mốc phụ thuộc vào chủng nấm mốc và phụ thuộc vào từng loại enzyme của các chủng giống đó. Như chủng nấm mốc Aspergillus oryzae sau 21-30 giờ nuôi cấy thì tích tụ lượng amylase lớn nhất. Sau đó bắt đầu tích tụ protease và đạt cực đại ở giai đoạn ban đầu tạo thành bào tử. Thời gian sinh tổng hợp protease thường ở giai đoạn bắt đầu tạo nhiều bào tử.Theo Doekhov và Conovalov (1968), sự tổng hợp protease acid ở nấm mốc xảy ra chủ yếu ở pha sinh trưởng, sau khi nuôi 24 giờ khỏang 70% enzyme tổng hợp đã được tạo thành. Với đa số nấm mốc, thời gian nuôi từ 35- 42 giờ khi nuôi bằng phương pháp bề mặt, khi nuôi bằng phương pháp bề sâu thời gian thường vào khỏang 40 – 48 giờ.- Lượng giống nuôi cấy:Lượng giống nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sinh tổng hợp protease đặc biệt là của nấm mốc. Tỉ lệ giống được đưa vào cao thường quan sát thấy hệ sợi sinh trưởng khi đã xuất hiện bào tử. Nếu giảm tỉ lệ giống dẫn đến giảm hệ sợi sinh trưởng ở dạng đã xuất hiện bào tử và hiệu suất sinh protease giảm theo.Khi nghiên cứu về hóa học tế bào, Ohama và Tomonaga nhận xét rằng hệ sợi nấm mốc phân bố thành các lớp khác nhau, nhưng chỉ trên bề mặt lớp rất mỏng mới có tổng hợp protease mạnh. - Ảnh hưởng của pH mơi trường:Khi nuơi cấy bằng phương pháp bề mặt, pH ít ảnh hưởng đến quá trình tạo enzyme vì mơi trường rắn cĩ tính đệm cao, pH gần như khơng đổi trong quá trình nuơi cấy. Đa số nấm mốc cĩ pH thích hợp cho tổng hợp protease là 6 – 6,5.Khi nuơi cấy bề sâu, pH mơi trường ảnh hưởng rất lớn trong quá trình nuơi cấy, pH mơi trường thay đổi khi thanh trùng và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuơi cấy. Trong quá trình nuơi cấy tùy thành phần mơi trường và các sản phẩm trao đổi chất ở nấm mốc, pH mơi trường chuyển dần về acid hay kiềm. Theo một số tác giả, pH mơi trường ảnh hưởng đến tỉ lệ các protease được tổng hợp. Do đĩ, nếu giữ pH luơn cĩ một giá trị xác định trong suốt quá trình nuơi cấy, nấm mốc sẽ tổng hợp enzyme protease chiếm ưu thế trong mơi trường. II. Nguồn nguyên liệu thu nhận protease Các protease khá phổ biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, sự phân bố của chúng khơng đồng đều ở các lồi, các mơ, các cơ quan khác nhau. Một lồi, cơ quan và mơ của động thực vật cĩ chứa một hay một số protease nhất định cĩ thể dùng làm nguồn nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng.Nguyên liệuEnzymeGhi chúTụy tạngTrypsinChymotrypsinCarboxy peptidase ACarboxy peptidase BCác enzyme này tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.Màng nhày dạ dày của người , lợn, chó, gà, thỏ. Dạ dày động vật có sừng còn non.Pepsin APepsin B, C, DGastrisinReninCác enzyme này tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.Gan, lá lách, thận, phổi, cơ lá lách, tim, cơ thận, dạ con.Catepxin A, B, C, DLeucinaminopeptidaseEnzyme ở trong tế bào, không sản xuất chế phẩm.Huyết tương, mủ cây đu đủ, các cây ficus, sung, vả (quả); lá, thân quả dứa đặc biệt là vỏ quả.TrombinPapainPlazminFixinBromelinMột số nguyên liệu động và thực vật dùng thu nhận protease Vi sinh vậtpH tối thíchpH ổn địnhLoại proteaseAsp.flavus8,5 -105 – 10KiềmAsp.oryzae32,5 – 6AcidKiềmCarboxypeptidaseAsp.saitoi2,5 – 32,5 – 6AcidAsp.sojae8,5 – 106,5 – 7,55 – 95 – 9KiềmTrung tínhMucor michei43 – 8AcidMucor pusillus44 – 6AcidRhizopus chinensis2,9 – 3,32,8 – 6,5AcidRh.niveus2,9 – 3,32,8 – 6,5AcidStreptomyces fladiae107 – 87 – 114 – 8AminopeptidaseCarboxypeptidaseBacillus subtilis10,3 – 10,85 – 11KiềmB.allophilic10 - 124 – 12KiềmMột số chủng vi sinh vật có khả năng sinh protease III. Thu nhận chế phẩm enzyme từ vi sinh vật Vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc) Nuôi cấy bề sâu Nuôi cấy bề mặt/MT rắn Canh trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn Canh trường rắn nuôi cấy nấm mốc Ly tâm Nghiền nhỏ Khuấy Bỏ bã Dung dịch E loãng Trích ly E Cô đặc Ly tâm (lọc) bỏ bã Dịch E Ly tâm (lọc) bỏ bã Dịch E Muối hay dung môi Dung dịch E Kết tủa E Muối hay dung môi Kết tủa EBỏ dung dịch Ly tâm Thu tủa E Thu tủa E Bỏ dung dịch Sấy khô Sấy khô (t0  500C) (t0  500C) Chế phẩm enzyme Chế phẩm enzyme Giá đậu Bã đậu + Bột mì   Nước Nước trộn đều   Đun sôi Chia vào các hộp nhôm hoặc erlen   Lọc Hấp thanh trùng   Thạch  Nước đậu  Đường   Đun sôi Nuôi   Chia vào ống nghiệm Trộn với bột mì đã rang chín   Hấp thanh trùng Rây  Loại bã   Nghiêng ống nghiệm Bột bào tử giống cho sản xuất  Cây mốc giống  Nuôi mốc  Ống mốc giốngQuy trình sản xuất bột bào tử(Từ Mucor sp.) Đậu nành  Xay  Dịch sữa đậu nành   H2O Đun sôi  CaSO4  Kết tủa  Chắt nước Nước đậu  Cho gia súc  Hoa đậu  Ép định hình  tách nước  Đậu hũ miếng  Bột bào tử nấm mốc  Nuôi mốc  Muối NaCl  Ướp muối  Lên men   dung dịch NaCl Chao1. Ứng dụng chế phẩm từ Mucor.sp trong công nghệ sản xuất chaoIV. Ứng dụng Các chỉ tiêu theo dõi:a. Giai đoạn ủ mốc- Sự biến đổi về hoạt tính protease của mốc chao theo thời gian ủ mốc: Thông thường, từ 6 giờ trở đi đã có sự tổng hợp enzyme protease và hoạt tính protease bắt đầu gia tăng nhẹ từ thời điểm 6 giờ trở đi và đạt hoạt tính protease cao nhất ở thời điểm 36 giờ, sau đó giảm nhẹ ở thời điểm 42 và 48 giờ. Dựa trên hoạt tính protease ta nên kết thúc giai đoạn ủ mốc ở thời điểm 36 giờ đối với chao loại A. - Sự biến đổi N-Formol/NL (%) theo thời gian: Từ 0 giờ đến 18 giờ, lượng N-Formol/NL (%) hầu như không đổi. Mặc dù trong giai đoạn này đã xảy ra hiện tượng sinh trưởng và phát triển của nấm mốc cùng với sự tích tụ enzyme, tuy nhiên chưa thấy có hiện tượng phân giải protid thành N-Formol. Từ 24 giờ trở đi hàm lượng N-Formol bắt đầu gia tăng nhẹ theo thời gian, đặc biệt tăng rõ từ thời điểm 36 – 48 giờ. - Sự biến đổi hàm lượng N-Amin/NL (%): Từ 0-24 giờ , hàm lượng N-Amin giảm dần vì trong giai đoạn này chỉ có hiện tượng khử N-Amin đơn thuần có trong nguyên liệu (đậu hũ) để tạo thành NH3 chứ chưa thấy vai trò enzyme vi sinh vật giúp chuyển protein thành peptid hay acid amin. Chính vì vậy, ta thấy trong thời gian này hàm lượng N-Formol hầu như không đổi, N-amoniac tăng dần và N-amin giảm dần. Từ 24-48 giờ: Hàm lượng N-amin tăng dần, đặc biệt tăng rõ từ thời điểm 36 giờ trở đi vì thời gian này mốc bắt đầu phát triển mạnh, lượng protease tích lũy ngày cành nhiều với hoạt tính phân giải protein cao, do đó lượng N-Formol tăng nhanh hơn nhiều so với sự gia tăng lượng N-amoniac, chính vì vậy lượng N-amin tích lũy ngày càng nhiều. b. Giai đoạn lên men- Sự biến đổi hàm lượng N-Formol/SP (%): Hàm lượng N-Formol/SP (%) tăng dần và đạt giá trị cao nhất (cả phần nước lẫn phần cái) vào thời điểm 18 ngày, sau đó giảm dần theo thời gian. Ta nên kết thúc giai đọan lên men chính ở 18 ngày là tốt nhất.- Sự biến đổi hàm lượng N-amin/SP (%): Hàm lượng N-amin/SP (%) tăng dần và đạt giá trị cao nhất vào thời điểm 18 ngày, sau đó giảm nhẹ theo thời gian. Ta nên kết thúc giai đọan lên men chính ở 18 ngày là tốt nhất.- Sự biến đổi về độ chua: Độ chua đạt yêu cầu ở thời điểm ngày lên men thứ 15.Lên men chao bổ sung chế phẩm nấm mốc Mucor so với lên men tự nhiên có nhiều ưu điểm:Hàm lượng N-amin và N-Formol tăng cao với tốc độ nhanh hơn.Độ chua sản phẩm thấp hơn.Hạn chế tối đa việc nhiễm và mọc các mốc lạ có thể gây độc hại cho người dùng cũng như tránh được mùi vị khó chịu làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm chao.2. Ứng dụng chế phẩm protease trong công nghệ chế biến sữaThông thường người ta dùng rennin làm đông tụ sữa trong sản xuất fromage. Ngày nay người ta đã có các chế phẩm từ vi khuẩn hay từ nấm mốc có hoạt tính enzyme tương tự rennin có thể thay thế một phần rennin (từ 25-55%)3. Ứng dụng chế phẩm protease trong công nghiệp chế biến cáSử dụng enzyme để làm mềm các loại cá có thịt khô và cứng. Trong quá trình muối cá mòi dùng chế phẩm protease sẽ giúp tăng nhanh quá trình muối và làm chín cá mòi từ 4 tháng xuống 18 ngày, ngòai ra còn làm giảm mùi tanh của cá.Nước mắm là dịch thủy phân protein của cá nhờ hệ enzyme protease có trong cá, cũng như các vi khuẩn gây thối có trong ruột, mang cá mà chủ yếu là B.substilis. B.memsentericus. Nếu bổ sung thêm nguồn protease nấm mốc thì quá trình sản xuất đựoc rút ngắn đi nhiều. Cụ thể nếu thêm 10% chế phẩm nấm mốc Asp.oryzae thì thời gian ướp cá có thể chỉ từ 17-60 giờ.* Thử nghiệm sản xuất nước mắm cá cơm bằng protease B.substilis: Thời gian thu nước mắm từ cá cơm là 21 ngày so với không bổ sung chế phẩm protease là 3 tháng. Nguyên liệu  Xay nhỏ  Muối ăn  Thủy phân  Protease B.substilis  Kéo, rút, lọc  Nước cốt Nước muối 220B  Bã 1  Dịch chiết 1 Dịch chiết 2  Bã 2 Dịch chiết 2 Phá bã Pha đấu   Xác mắm Đóng chai   Phân bón Thành phẩmQuy trình sản xuất nuớc mắm ngắn ngày 4. Trong công nghiệp thịtProtease có tác dụng làm mềm thịt, tạo vị ngon hơn, cho phép dùng các loại thịt kém chất lượng (dai) làm nguyên liệu sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm thịt từ 20 – 40%, sản phẩm sau khi nấu sẽ dễ tiêu hóa hơn nhiều, hàm lượng acid amin tăng đáng kể. Những chế phẩm protease của Asp.flavus, Asp.terricola, Asp.rimosus ... được dùng nhiều trong quá trình làm chín thịt.