Các phương pháp phân tích định lượng vi sinh vật

CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN TÍCH ÑÒNH LÖÔÏNG VI SINH VAÄT I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP - Dùng để xác định các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn. - Quy trình cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật -Không phân biệt được tế bào sống và chết -Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật và hạt vật thể -Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu trên kính hiển vi I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP 1. Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu Quy trình: - Pha loãng mẫu (5-10 tế bào/ô nhỏ) - Nạp mẫu vào buồng đếm - Đếm số lượng tế bào hiện diện trong 5 ô lớn Tính mật độ: Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml a: trung bình cộng số lượng tế bào trong 5 ô lớn I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC - Dùng để xác định các loại vi sinh vật sống trong mẫu - Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp - Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di động II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Quy trình: - Pha loãng mẫu (25-250 khuẩn lạc/đĩa) - Tạo hộp đổ - Nuôi ủ, đếm số lượng II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Máy đếm khuẩn lạc Bút đếm khuẩn lạc II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Tính kết quả: Vôùi : N: soá teá baøo (ñôn vò hình thaønh khuaån laïc) vi khuaån trong 1g hay 1ml maãu. C: Toång soá khuaån laïc ñeám ñöôïc treân caùc hoäp petri ñaõ choïn n1 : Soá hoäp petri caáy taïi ñoä pha loaõng thöù i di: heä soá pha loaõng töông öùng. v: theå tích dòch maãu (ml) caáy vaøo trong moãi ñóa )...( )//( 11 iivdnvdn C mlghayCFUCFUN    Ñònh löôïng toång vi sinh vaät hieáu khí 10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter Đồng nhất bằng stomacher / 30 giây Dung dịch 10 -1 Pha lõang 10-2, 10-3, 10-4,.. Cấy 1ml/petri – 3 độ pha loãng liên tiếp – 2 petri/độ pha lõang Cho 15-20 ml PCA/petri. Lắc đều Tổng VSV hiếu khí/g (TPC) N TPC = n1V1F1 + .+ niViFi N: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng độ V: Thể tích cấy (=1) ; F: độ pha lõang Ñònh löôïng toång vi sinh vaät hieáu khí Để đông đặc Lật ngược đĩa, ủ ấm 30±1oC/ 72±6h Khuẩn lạc Chọn đĩa có 25 – 250 khuẩn lạc  đếm III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC - Định lượng vi sinh vật có mật độ thấp - Định lượng thông qua số lượng khuẩn lạc III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC - Kích thước lỗ lọc: 0,45 m hoặc 0,2 m - Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC Bộ lọc và màng lọc vô trùng III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC Quy trình: - Khử trùng dụng cụ lọc - Lọc chân không - Nuôi cấy màng lọc trên môi trường dinh dưỡng - Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri Tính mật độ: MPN = N x ln(N/N - x) Với: N: Tổng số các ô vuông x: số ô có khuẩn lạc mọc III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC Vi khuẩn phát triển trên màng lọc IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM - Kỹ thuật dùng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men - Kỹ thuật dễ thao tác - Tiết kiệm không gian ủ, bảo quản, thời hạn sử dụng lâu - Không cần hấp khử trùng môi trường IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) - Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu - Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau - Kết quả định tính: sinh hơi, đổi màu, hoá đục của môi trường nuôi cấy  dương tính - Độ chính xác phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại ở mỗi độ pha loãng (3 hoặc 5 lần) - Phương pháp dùng định lượng mọi nhóm vi sinh vật nuôi trên môi trường chọn lọc, cho kết quả biểu kiến. IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) Phương pháp MPN (loạt 5 ống) IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) Bảng tra MPN (loạt 3 ống) Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng 10 1 0,1 0 0 0 - 0 0 1 3 0 0 2 6 0 0 3 9 3 3 0 240 3 3 1 460 3 3 2 1100 3 3 3 - IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) Bảng tra MPN (loạt 5 ống) IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) Quy trình: - Pha loãng mẫu bậc 10,chọn 3 nồng độ liên tiếp - Cấy vào loạt ống nghiệm (9 hoặc 15 ống) chứa môi trường chọn lọc một lượng mẫu xác định từ 3 nồng độ đã chọn - Nuôi ủ, xác định số ống dương tính ở 3 nhóm - Tra bảng Mac Cradytrị số MPN (a) Tính mật độ: Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x x d Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady V2: thể tích mẫu sử dụng (thường là 1) V1: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml) d: hệ số pha loãng ở loạt ống đầu tiên 1 2 V V V. PHƯƠNG PHÁP ÑO ÑOÄ ÑUÏC V. PHƯƠNG PHÁP ÑO ÑOÄ ÑUÏC V. PHƯƠNG PHÁP ÑO ÑOÄ ÑUÏC - Ñoä ñuïc cuûa huyeàn phuø tyû leä thuaän vôùi soá löôïng teá baøo vi sinh vaät coù trong moâi tröôøng. Trong moät giôùi haïn nhaát ñònh, moái quan heä giöõa soá löôïng vi sinh vaät trong moâi tröôøng tyû leä tuyeán tính vôùi ñoä ñuïc cuûa moâi tröôøng.  Do ñoù coù theå ñònh löôïng vi sinh vaät trong moâi tröôøng baèng maùy ño ñoä ñuïc hay maùy so maøu ôû böôùc soùng 550 – 610nm. - Trong phöông phaùp naøy caàn xaây döïng bieåu ñoà töông quan tuyeán tính giöõa ñoä ñuïc vaø soá löôïng vi sinh vaät coù trong moâi tröôøng baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc tröïc tieáp V. PHƯƠNG PHÁP ÑO ÑOÄ ÑUÏC * Phöông phaùp tieán haønh: - Pha loaõng huyeàn phuø chöùa vi sinh vaät caàn kieåm nghieäm sao cho caùc dung dòch thu ñöôïc khi ño treân maùy so maøu ôû böôùc soùng 610nm ñöôïc caùc trò soá OD gaàn 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. - Duøng phöông phaùp ñeám tröïc tieáp xaùc ñònh löôïng teá baøo vi sinh vaät coù trong 1ml kyù hieäu N/ml. - Tính giaù trò log (N/ml) cho töøng möùc noàng ñoä pha loaõng. Veõ ñoà thò bieåu dieãn log (N/ml) theo caùc giaù trò OD. Xaùc ñònh khoaûng tuyeán tính giöõa log (N/ml) vôùi OD. * Tính maät ñoä: - Töø trò soá OD ño ñöôïc ñoái chieáu treân ñoà thò töông quan giöõa maät ñoä teá baøo vaø OD ñeå xaùc ñònh löôïng teá baøo coù trong maãu nghieân cöùu. N/ml = 10 a vôùi a=log (N/ml). VI. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) - ELISA (Phöông phaùp haáp phuï mieãn dòch duøng enzyme) döïa treân nguyeân taéc phaûn öùng keát hôïp giöõa teá baøo (khaùng nguyeân) vôùi moät khaùng theå ñaëc hieäu. - Tín hieäu phaûn öùng mieãn dòch ñöôïc nhaän bieát qua söï ngöng tuûa, keát dính cuûa khaùng nguyeân-khaùng theå hoaëc baèng nhöõng khaùng theå ñaõ ñöôïc ñaùnh daáu (phaùt huyønh quang, ñoàng vò phoùng xaï hay enzym). VI. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) VI. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) Ñóa ELISA VII. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction) - Phöông phaùp PCR duøng ñeå toång hôïp DNA döïa treân khuoân DNA ban ñaàu, khueách ñaïi, nhaân soá löôïng baûn sao cuûa khuoân naøy thaønh haøng trieäu baûn sao nhôø enzym polymerase moài ñaëc hieäu. - Phaûn öùng PCR goàm nhieàu chu kyø laëp laïi noái tieáp. Moãi chu kyø goàm 3 böôùc: + Bieán tính: Maïch ADN taùch thaønh daïng maïch ñôn (94-95 o C, 30-60 giaây) + Lai: caùc moài baét caëp vôùi maïch khuoân (40-70 o C, 30-60 giaây) + Keùo daøi: Enzyme Polymerase hoaït ñoäng, toång hôïp AND (72 o C, 30 giaây – vaøi phuùt) - Chu kyø ba böôùc laëp laïi nhieàu laàn, sau 30-40 chu kyø seõ taïo ra 10 6 baûn sao. - Sau phaûn öùng PCR, ADN ñöôïc nhuoäm bôûi ethidium bromide, quan saùt qua ñieän di saûn phaåm PCR trong gel agarose vaø quan saùt döôùi tia UV VII. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction) VII. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction) VII. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction) Quy trình thöïc hieän: - Taêng sinh: vi sinh vaät ñöôïc nuoâi caáy taêng sinh treân moâi tröôøng choïn loïc (TSB) 10-20 giôø. - Taùch chieát DNA vi sinh vaät - Thöïc hieän phaûn öùng PCR - Ñieän di treân gel agarose 1,5%, ñoïc keát quaû treân ñeøn UV. VIII. PHƯƠNG PHÁP PHAÙT QUANG SINH HOÏC ATP -Phaân töû ATP hieän dieän ôû taát caû caùc teá baøo sinh vaät soáng. ATP coù theå ñöôïc phaùt hieän moät caùch nhanh choùng bôûi löôïng aùnh saùng phaùt ra thoâng qua söï keát hôïp vôùi enzym luciferase nhôø moät maùy ño saùng. Cô cheá phaûn öùng phaùt quang cuûa phöông phaùp xaûy ra nhö sau: Luciferase + Luciferin + ATP  Luciferase-Luciferin AMP + PPi Luciferase-Luciferin AMP + O2  Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (phaùt quang) -Kyõ thuaät naøy coù theå phaùt hieän ñöôïc 1pg ATP (10 -12 g) töông ñöông vôùi khoaûng 1000 teá baøo vi khuaån (10 -15 g ATP/teá baøo). - Söï phaân tích ñöôïc thöïc hieän nhanh choùng chæ dieãn ra trong vaøi phuùt. VIII. PHƯƠNG PHÁP PHAÙT QUANG SINH HOÏC ATP Dụng cụ quẹt bề mặt Máy đo sáng VIII. PHƯƠNG PHÁP PHAÙT QUANG SINH HOÏC ATP