Các phương pháp chung phân lập chất hữu cơ

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUNG PHÂN LẬP CHẤT HỮU CƠ Chất độc hữu cơ chiếm đa số trong kiểm nghiệm độc chất. Nhiều tác giả nghiên cứu cách phân loại chúng. Dựa vào phương pháp phân lập có thể xếp thành ba nhóm sau:Nhóm chất độc phân lập bằng phương pháp cất.Nhóm chất độc không bay hơi phân lập bằng phương pháp chiết ở hai môi trường.Nhóm chất độc đòi hỏi phương pháp tách riêng biệt. I. PHƯƠNG PHÁP CẤT KÉO HƠI NƯỚC: Phương pháp cất kéo hơi nước là một kỹ thuật cơ bản để phân lập các chất được áp dụng trong KNĐC. Nó dùng để tách chất độc bay hơi khỏi mẫu phân tích. I. PHƯƠNG PHÁP CẤT KÉO HƠI...1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT: Đun hỗn hợp 2 chất A và B không hoà tan vào nhau thì áp suất hơi riêng phần của chúng tăng lên và không phụ thuộc vào nhau. Khi tổng áp suất hơi riêng phần (P = PA + PB) bằng áp suất khí quyển trên bề mặt thì hỗn hợp đó sôi.  Như vậy mỗi chất/hỗn hợp sẽ sôi ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của nó. I. PHƯƠNG PHÁP CẤT KÉO HƠI...1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT... mA và mB là khối lượng (g) của khí A và B trong hỗn hợp.  Trong điều kiện lý tưởng thì:I. PHƯƠNG PHÁP CẤT KÉO HƠI...1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT... Có thể tính được tỉ lệ phần trăm C (%) khối lượng của A và B trong pha hơi: Khối lượng chất i trong pha hơi phụ thuộc vào Pi. Muốn mA nhiều nhất trong pha hơi thì mB càng nhỏ càng tốt. Do đó nước thường được dùng làm dung môi vì có áp suất hơi nhỏ. I. PHƯƠNG PHÁP CẤT KÉO HƠI...2. KĨ THUẬT CẤT: Mẫu thử cho vào bình (2), nếu cần thiết xay nhỏ. Thêm nước cất (để hỗn hợp sền sệt như cháo). Acid hoá mẫu thử (acid tactric hoặc oxalic 10%) không dùng acid vô cơ (sợ phân huỷ chất độc). Đặt bình (2) vào nồi cách thủy (3), nối với bình sinh hơi (1) I. PHƯƠNG PHÁP CẤT KÉO HƠI...2. KĨ THUẬT CẤT: Cất nhỏ lửa để bốc hơi từ từ, sản phẩm hứng vào (các) bình (5). Nếu có chỉ định cần xác định chất độc nào trong mẫu thử thì lấy ngay dịch cất để phân tích. Nếu không có chỉ định cụ thể thì ta lấy riêng dịch cất vào nhiều bình khác nhau. I. PHƯƠNG PHÁP CẤT KÉO HƠI...2. KĨ THUẬT CẤT: CÁCH HỨNG MẪU THEO SVAICOVA: Dịch cất được hứng vào 4 bình nón: Bình 1 có 2 ml dd NaOH 5%. Cất lấy 15ml để xác định cyanid và một số chất khác. Cất tiếp vào 3 bình nón khác mỗi bình lấy 25- 50 ml. Nếu thấy kết quả dương tính chất nào thì cất cho đến khi không còn phản ứng chất đó trong dịch cất. Thứ tự phân tích như sau: cyanid và dẫn xuất halogen mạch thẳng (cloralhydrat, cacbon tetraclorid), rượu methylic, etylic, aldehyd, benzen, anilin, phenol... Các dịch cất sau để kiểm tra lại khi cần. I. PHƯƠNG PHÁP CẤT KÉO HƠI...2. KĨ THUẬT CẤT: CÁCH HỨNG MẪU THEO KOHN- ABREST : Với 300g mẫu thử lấy 300ml dịch cất. Nhận xét màu, mùi dịch cất. Lấy 1/6 dịch cất để tìm dẫn xuất halogen mạch thẳng, cloralhydrat, crezol, phenol. Phần còn lại cất lần thứ 2 lấy 100ml, cất thêm lần thứ 3 lấy 35 ml. Lấy 1/2 dịch cất lần cuối cùng để xác định cyanid, phenol, cloroform, formol, benzen. Nửa còn lại xác định rượu. II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ: Chiết là quá trình phân bố một chất giữa 2 pha lỏng không trộn lẫn vào nhau, thường là dung môi hữu cơ và nước. Khi lắc 2 chất lỏng phân tán vào nhau làm tăng tốc độ phân bố chất tan giữa hai chất lỏng Tốc độ lắc càng tăng, kích thước trung bình của hạt càng giảm và như vậy bề mặt tiếp xúc giữa 2 chất lỏng càng tăng  làm tăng tốc độ chiết xuất. Nhưng giọt chất lỏng quá bé thì sự lưu thông trong giọt hầu như bị ngừng lại và thời gian phân chia pha kéo dài Nếu lắc quá nhanh sẽ tạo thành nhũ dịch. II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT...1. NGUYÊN TẮC CHUNG CHIẾT XUẤT CHẤT ĐỘC HỮU CƠ: Hiệu suất chiết chất độc từ một mẫu thử phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Tuỳ tính chất của chất độc và đặc điểm của mẫu thử mà chọn điều kiện chiết thích hợp. Thông thường quá trình chiết gồm các giai đoạn: 1. Xử lý sơ bộ mẫu thử 2. Chọn điều kiện cho quá trình chiết và chiết xuất 3. Loại tạp chất 4. Xác định chất độc. II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT...1. NGUYÊN TẮC CHUNG CHIẾT XUẤT CHẤT ĐỘC HỮU CƠ: a. Xử lý sơ bộ mẫu thử: Giai đoạn này cần tạo điều kiện cho chất độc tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ. Nếu chất độc nằm ở dạng liên kết thì cần thủy phân cắt dây nối đó như với protein chẳng hạnVí dụ: chiết morphin trong nước tiểu cần thủy phân trong dd HCl). Nếu chất độc nằm trong một khối lượng mẫu thử quá lớn cần làm giầu chất độc: tách sơ bộ bằng dung môi thích hợp, ví dụ: cồn – acid, nước- acid...II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT...1. NGUYÊN TẮC CHUNG CHIẾT XUẤT CHẤT ĐỘC HỮU CƠ: b. Chọn điều kiện cho quá trình chiết và chiết xuất: Sau khi xử lý sơ bộ, chọn điều kiện pH, số lượng và loại dung môi chiết thích hợp. Các độc chất thường có tính acid hoặc base yếu. Nên Giai đoạn đầu chiết ở pH acid nhẹ (dùng các acid hữu cơ) để chiết được tất cả các acid yếu thường gặp. Sau đó đưa pH sang vùng kiềm nhẹ (dùng NH3 hay NaHCO3) để chiết được hầu hết các alcaloid và base tổng hợp. II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT...1. NGUYÊN TẮC CHUNG CHIẾT XUẤT CHẤT ĐỘC HỮU CƠ: Trong độc chất thường dùng ete và cloroform. Ete hoà tan được nhiều chất, tuy vậy có nhược điểm là bay hơi quá nhanh, dễ bắt lửa. Cloroform cũng là dung môi tốt phân chia nhanh khỏi pha nước nhưng có nhược điểm là dễ tạo nhũ dịch. b. Chọn điều kiện cho quá trình chiết và chiết xuất... II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT...1. NGUYÊN TẮC CHUNG CHIẾT XUẤT CHẤT ĐỘC HỮU CƠ: Quá trình chiết để xác định chất độc tiến hành ở môi trường acid và môi trường kiềm. Nên được gọi là cách chiết với dung môi ở hai môi trường. Việc chiết xuất ở môi trường acid sẽ có nhiều tạp chất. Nếu không phải xác định các chất ở môi trường này thì cũng nên chiết ở pH acid để loại bỏ bớt tạp chất cho giai đoạn chiết ở môi trường kiềm.. b. Chọn điều kiện cho quá trình chiết và chiết xuất... II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT...1. NGUYÊN TẮC CHUNG CHIẾT XUẤT CHẤT ĐỘC HỮU CƠ: c. Loại tạp chất: Dịch chiết (ete/cloroform) thường có nhiều tạp chất. Có nhiều cách tinh khiết hoá:Cho qua cột than hoạt tính, hoặc cột ionit. Thăng hoa để lấy chất độc (barbiturat). Chiết lại từ dung môi bằng dung dịch nước acid (để lấy base yếu) hoặc dung dịch nước kiềm (để lấy acid yếu). Sắc kí giấy và lớp mỏng. d. Xác định chất độc : bao gồm định tính và định lượng bằng phương pháp hoá học hoặc hoá lý thích hợp. II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT... 2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCHCHIẾT THÔNG DỤNG : a. Phương pháp StassOtto: Xử lý mẫu trước khi chiết: Các alcaloid và base trong mẫu được chuyển sang dạng muối của acid tactric hoặc oxalic. Hoà tan vào nước và cồn các muối đó. Bốc hơi cồn ở nhiệt độ thấp trong chân không để loại chất đạm và 1 số tạp chất hữu cơ khác (chú ý để tránh phân hủy một số alcaloid do nhiệt độ). (Loại mỡ khỏi dung dịch nước- acid bằng ete dầu hoả - Kohn-Abrest và Truhaut ) . II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT... 2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCHCHIẾT THÔNG DỤNG : a. Phương pháp StassOtto: Xử lý mẫu trước khi chiết: Chiết bằng dung môi hữu cơ: giai đoạn đầu chiết ở môi trường acid để lấy các acid hữu cơ, dẫn xuất barbiturat, các phenol, heterosid. Giai đoạn hai kiềm hoá bằng amoniac để chiết lấy các alcaloid. Dịch chiết ete và cloroform có nhiều tạp chất, nên phải làm sạch dịch chiết. 2. Một số phương pháp táchchiết thông dụng...b. Phương pháp tách bằng cồn  acid của Svaicova: Xử lý sơ bộ mẫu trước khi chiết: Thêm cồn 950 đến ngập mẫu và acid hoá (acid oxalic hoặc tactric 10% - dung dịch pha trong cồn). Lắc đều và để yên một thời gian, nếu thiếu acid thì cho thêm. Để 24 giờ ở 25-300C. Sau đó gạn phần cồn và thêm phần cồn mới vào (môi trường luôn acid). Tiến hành ngâm mẫu thử bằng cồn như trên 3-4 lần. Gộp phần cồn gộp lại rồi bốc hơi ở áp suất giảm (nhiệt độ dưới 400C) đến khi như xiro. Dùng cồn (từng giọt) để kết tủa albumin. Lọc, rửa, bỏ tủa. Việc kết tủa albumin làm nhiều lần cho đến khi hết. Dùng 30ml ete dầu hoả (chia 3 lần) để loại mỡ từ dung dịch nước. Cô đuổi ete dầu hoả. 2. Một số phương pháp táchchiết thông dụng...b. Phương pháp tách bằng cồn  acid của Svaicova: Chiết: Bằng ete hoặc cloroform 3- 4 lần mỗi lần 10-15ml lúc đầu ở môi trường acid, sau ở môi trường kiềm (kiềm hoá bằng NH4OH hoặc NaHCO3). Lọc lớp ete và cloroform qua giấy lọc khô để loại vết nước (mang theo chất bẩn vào). Riêng phần dịch chiết ở môi trường acid cần rửa bằng nước cất 3 lần để loại các chất trước khi lọc qua giấy khô. Đuổi dung môi khỏi dịch chiết và làm phản ứng xác định. 2. Một số phương pháp táchchiết thông dụng...c. Phương pháp tách bằng cồn -acid của Kohn-Abrest : Xử lý sơ bộ mẫu trước khi chiết: Tương tự như Svaicova nhưng dùng nhiệt độ (50-60oC) và ngắn hơn Chiết như Svaicova nhưng giai đoạn kiềm dùng 2 loại dung môi (ete và cloroform) để chiết triệt để hơn Các bước cụ thể xem tài liệu 2. Một số phương pháp táchchiết thông dụng...d. Phương pháp làm khô mẫu thử: Phương pháp của Svaicova và Kohn Abrest rất phổ biến nhưng albumin hoà tan nhiều mất thời gian loại, vừa tốn cồn, vừa dễ mất chất cần chiết. Để khắc phục nhược điểm cồn bị giảm nồng độ do nước trong mẫu thử nên albumin hoà tan dễ dùng một số chất để làm khô như amoni sulfat, natri sulfat trước khi thực hiện các bước tiếp theo.Thời gian chỉ mất 1 ngày mà loại đực hết albuminĐể giảm lượng chất làm khô để phủ tạng xay nhỏ trong bình hút ẩm trước (1 ngày). 2. Một số phương pháp táchchiết thông dụng...e. Các phương pháp chiết liên tục: Nguyên tắc của chiết liên tục là dùng một lượng cồn nhất định qua hệ thống hồi lưu và đi qua mẫu thử nhiều lần để lấy hết các chất cần thiết. Nhiều tác giả đã thiết kế những dụng cụ khác nhau để chiết liên tục như Umbeger, Stolman, Curry: dụng cụ khá cầu kỳ. ở nước ta thường dùng phương pháp cất bằng bình Soxhlet. 2. Một số phương pháp táchchiết thông dụng...e. Các phương pháp chiết liên tục... Phương pháp cất bằng bình Soxhlet:Cho mẫu thử đã xay nhỏ trộn với Na2SO4 khan vào giấy lọc, cuộn thành túi dài. Đổ cồn 900 ngập hỗn hợp nhưng không quá vòi uốn khúc.Cho vào bình cất ít NH4SO4 và phần cồn còn lại. Cất cách thủy áp lực giảm ở nhiệt độ dưới 600C, cồn ở bình nhận bốc hơi gặp ống sinh hàn ngưng tụ lại rồi vào bình chiết. Khi cồn cao quá ống uốn khúc thì chảy vào bình nhận. Hoạt chất nằm lại bình, cồn tiếp tục bay hơi. Quá trình cứ thế tiếp diễn.Kết thúc, cất thu hồi cồn,đem chiết bằng dung môi như các phương pháp trên. 2. Một số phương pháp táchchiết thông dụng...e. Các phương pháp tách- chiết bằng nước: Phương pháp Dragendorf: Acid hoá mẫu thử bằng H2SO4 ở 40-500C sau khi thêm nước Lọc lấy nước và bốc hơi đến lúc sền sệt như xiro. Thêm 3-4 thể tích cồn 950 ngâm 24 giờ để loại albumin. Lọc. Cô đuổi hết cồn. Làm sạch nhiều lần với ete dầu hoả, benzen. Lấy dung dịch thu được chiết ở hai môi trường ete, cloroform.Phương pháp Svaicova-Vasileva: Lấy lượng nước gấp hai lần mẫu thử. Ngâm 2 giờ thỉnh thoảng lắc. Lọc.Lấy dịch lọc chiết ở hai môi trường bằng ete hoặc cloroform.Phương pháp Florence: Mẫu thử được ngâm với dd acid tricloacetic 20% (dd=2/3 mẫu thử). Sau khi nghiền kỹ để cách thủy 350C trong 15 phút. LọcLoại tạp chất bằng ete dầu hoảGộp nước lọc lại, chiết bằng ete hoặc cloroform. 2. Một số phương pháp táchchiết thông dụng...e. Các phương pháp tách- chiết bằng nước... Phương pháp Daubney-Nickolls:Thêm nước và acid acetic, đun hỗn hợp ở 500C. Tiếp tục thêm amoni sulfat, đun và khuấy đều ở 650C. Lọc albumin qua phễu Buchner. Rửa bằng nước nóng. Bã còn lại đem ngâm với nước 65-750C. Tiếp tục làm như thế đến khi được khoảng 1500ml nước lọc.Kiềm hoá bằng amoniac và chiết bằng cloroform nhiều lầnDịch chiết cloroform đem acid hoá bằng acid sulfuric, sau đó chiết lại bằng một lượng cloroform ít hơn để lấy alcaloid. - Nếu có chỉ định tìm barbiturat thì thêm nước Thêm acid sulfuric 6N. Để yên nửa giờ, lọc lấy nước và chiết bằng ete 2lần. Tinh khiết hoá dịch chiết ete. II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT...3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH KHIẾT HOÁ DỊCH CHIẾT: a. Phương pháp chiết lại: Các chất độc có tính acid tan trong dung môi:Chuyển thành muối tan trong nước bằng cách lắc dịch chiết với dung dịch NaOH. Lấy lớp nước đem acid hoá và chiết lại bằng ete vài lần. Dịch chiết ở môi trường kiềm: Lắc vài lần với dung dịch acid nước. Lấy phần nước gộp lại và kiềm hoá rồi chiết bằng dung môi vài lần. Có thể làm nhiều lần như thế để tinh khiết hoá dịch chiết.II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT...3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH KHIẾT HOÁ DỊCH CHIẾT: b. Phương pháp trao đổi ion: Trước khi định lượng alcaloid có thể tinh khiết hoá bằng cách: Cho qua cột cationid dung dịch nước của muối alcaloid. Alcaloid được giữ lại ở cột. Rửa cột bằng nước cất đến phản ứng trung tính. Đẩy alcaloid khỏi cột bằng 50ml dung dịch acid với tốc độ 2ml/ phút...CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUNG XÁC ĐỊNH CHẤT ĐỘC HỮU CƠ Chất hữu cơ và chất độc hữu cơ có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau.Các phương pháp quang phổ: tử ngoại khả kiến, hồng ngoại. Các phương pháp điện hoá: đo thế, cực phổ. Các phương pháp sắc ký:sắc ký giấy sắc ký lớp mỏng I. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI:1. Các yếu tố ảnh hưởng đến phổ hấp thụ:Dung môi: Khi thay đổi dung môi phổ hấp thụ thay đổi vị trí của cực đại và cực tiểu, độ lớn của hệ số hấp thụ riêng. Nếu dung môi và chất tan có phản ứng với nhau thì sự thay đổi càng rõ rệt. pH: ảnh hưởng của pH đến phổ hấp thụ tử ngoại có thể do một số nguyên nhân sau: Hình thành hoặc mất đi trung tâm mang điện tích trong phân tử. Thủy phân chất hữu cơ. Thay đổi cấu trúc phân tử. Tạp chất: là cản trở lớn nhất nên phải tinh khiết hoá trước khi đo phổ. I. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI: 2. Chuẩn bị mẫu thử để đo phổ hấp thụ: Để tạo dung dịch tinh khiết đem đo phổ, có thể dùng nhiều cách khác nhau. Nếu có chỉ định cụ thể: dựa vào tính chất lý hoá để quyết định kỹ thuật chuẩn bị mẫu thử. Trong trường hợp chung: có thể dùng một số phương pháp phân lập và tinh khiết hoá nào đó đã trình bày ở trên. Một số kỹ thuật xử lý mẫu thử khác được sử dụng nhiều trong kiểm nghiệm phục vụ cấp cứu ngộ độc.I. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI: Chiết thẳng các chất trung tính hoặc acid yếu với dung môi.Mẫu thử là nước tiểu thì chiết trực tiếp. Nếu là máu thì pha loãng với nước. Nếu là phủ tạng thì nghiền nhỏ và pha loãng bằng nước làm sao 1ml ứng với 0,2g. Lấy 25ml mẫu thử chiết với 100ml dung môi ở môi trường acid (điều chỉnh bằng thêm 5ml NaH2PO4 1M). Dung môi tốt nhất là CH2Cl2 (vì rất ít tạo nhũ dịch). 2. Chuẩn bị mẫu thử để đo phổ hấp thụ... Phương pháp Feldstein:I. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI: 2. Chuẩn bị mẫu thử để đo phổ hấp thụ... Phương pháp Feldstein... Hỗn hợp chiết  Lớp nước I (chiết các chất có tính base) Lớp dung môi I  Lớp nước II+ NaHCO3 (phân tích các chất có tính acid mạnh) Lớp dung môi II  Lớp nước III+ NaOH 5% (phân tích các chất có tính acid yếu) Lớp dung môi III (phân tích các chất trung tính) Chi tiết xem tài liệu. 2. Chuẩn bị mẫu thử để đo phổ hấp thụ... Phương pháp Sidney Kaye:  Các chất trung tính và acid yếu: Chiết với 25ml cloroform đã tinh chế (cất lại) thêm 2 giọt dung dịch HCl loãng. Lắc cẩn thận. Lọc lớp cloroform qua giấy lọc khô. Dùng 20ml dịch chiết cloroform lắc với 5ml dung dịch NaOH 0,5N. Sau khi phân lớp (nếu cần ly tâm loại hết cloroform) lấy 3ml dung dịch NaOH 0,5N (lớp nước) để ghi phổ hấp thụ, mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,5N bão hoà cloroform.  2. Chuẩn bị mẫu thử để đo phổ hấp thụ... Phương pháp Sidney Kaye: Các chất base hữu cơ : Lấy 25ml cloroform đã tinh chế lắc với 5ml mẫu đã kiềm hoá bằng dung dịch NaOH 25%. Lấy phần cloroform lọc qua giấy lọc khô. Lắc 20ml dịch chiết cloroform này với 5ml dung dịch H2SO4 0,5N. Lấy phần nước ly tâm loại hết cloroform và đem ghi phổ với dung dịch so sánh là H2SO4 0,5N bão hoà cloroform. I. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI: 3. Định tính: Dựa vào vị trí max và min trên phổ hấp thụ để định tính các chất: Ghi phổ chất nghiên cứu và so sánh với phổ chuẩn. Trường hợp này yêu cầu các máy quang phổ phải thật chuẩn hoá. Nếu có chất chuẩn tinh khiết, ghi phổ chất nghiên cứu và chất chuẩn trong cùng điều kiện so sánh. Nếu chất độc chiết từ mẫu thử có thể kết tinh được thì đo và tính giá trị hệ số hấp thụ riêng để có thêm thông tin định tính chất độc (so sánh các E tương ứng trong dung dịch NaOH 0,5N hay H2SO4 0,5N).I. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI: 4. Định lượng:Dựa trên định luật Lambert- Beer: D = kCl Đo mật độ quang D, với l = 1cm k là hệ số hấp thụ phân tử () hay hệ số hấp thụ riêng E sẽ tính được ra C (mol/l hay %) với điều kiện máy chuẩn cả về bước sóng và mật độ quang.Holmium: 1-10 và 13Didymium: 11-12 và 14-16Để kiểm tra độ chính xác của bước sóng: có thể quét phổ hấp thụ của các kính lọc chuẩn như Holmium hay Didymium 40mg K2CrO4 hay 30,3mg K2Cr2O7 pha trong 1 lít KOH 0,05NCũng có thể kiểm tra theo các dung dịch kiểm tra mật độ quang ghi trong các chuyên luận dược điển như các dung dịch K2CrO4 hay K2Cr2O7 để kiểm tra cực đại hấp thụ và các giá trị mật độ quang ở một số bước sóng xác định. (nm) D (nm) D (nm) D215 1.4318 295 0.2782 375 0.9872220 0.4559 300 0.1518 380 0.9281225 0.2218 305 0.0809 385 0.8182230 0.1675 310 0.0458 390 0.6840235 0.2076 315 0.0434 395 0.5229240 0.2933 320 0.0620 400 0.3872245 0.3893 325 0.0915 405 0.2840250 0.4962 330 0.1457 410 0.1972255 0.5719 335 0.2182 420 0.1261260 0.6345 340 0.3143 430 0.0841265 0.6968 345 0.4202 436 0.0650270 0.7447 350 0.5527 440 0.0535275 0.7620 355 0.6946 450 0.0325285 0.5952 360 0.8298 460 0.0173280 0.7235 365 0.9393 290 0.4295 370 0.9914I. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI: 4. Định lượng: Ngoài các phương pháp định lượng bằng đường chuẩn, thêm và thêm đường chuẩn, để hạn chế ảnh hưởng tạp chất có thể tiến hành đo vi sai theo pH hay bước sóng:D = DpH1  DpH2 = f (C)D = Dl1  Dl2 = F(C) II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT ĐO QUANG: Chiết xuất kết hợp với đo quang được sử dụng nhiều trong phân tích nên trong KNĐC thường gặp phương pháp này. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp là tạo ra các sản phẩm có thể chiết được bằng dung môi hữu cơ rồi đo quang xác định nồng độ chất độc. Về phương diện hoá học, sản phẩm màu này thường là phức hỗn hợp hoặc cặp ion.II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT ĐO QUANG: 1. Chiết phức hỗn hợp: Phức hỗn hợp tạo thành do sự liên kết của một ion kim loại (ion trung tâm) với hai loại phối tử khác nhau:M+Z + nX + mY = MXnYm Chất hữu cơ, cần xác định là một phối tử (ví dụ X). Khi chiết ta đưa ion kim loại M+Z và phối tử thứ hai (phối tử Y) vào dung dịch để tạo phức hỗn hợp. Phối tử Y này có thể là chất vô cơ hoặc hữu cơ. Có trường hợp Y chính là ion OH của dung dịch nước.II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT ĐO QUANG: 1. Chiết phức hỗn hợp: Theo phản ứng trên phức hỗn hợp tạo thành là do sự kết hợp ít nhất của ba tiểu phân  xác suất va chạm để tạo thành phức đó rất thấp và nó ảnh hưởng trực tiếp đến độ lặp lại của thí nghiệm. Hơn nữa, phức hỗn hợp tạo thành nhiều khi không phải ở trong cùng pha (cân bằng đồng thể) mà ở trong pha khác nhau (cân bằng dị thể). Ví dụ: phối tử Y tan trong dung môi hữu cơ, dung dịch nước có M+2 và phối tử X. Nhờ đưa đủ lượng M+2, Y và kết hợp với quá trình lắc sẽ chuyển toàn bộ lượng chất nghiên cứu X vào phức hỗn hợp tan trong dung môi. Hầu hết phức hỗn hợp tan trong dung môi ít phân cực dễ bị phân hủy khi tiếp xúc với nước  dung môi để chiết phải khan, dụng cụ phải khô. II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT ĐO QUANG: 1. Chiết phức hỗn hợp... Tất cả những điều kiện cho ta thấy việc chiết phức hỗn hợp khó khăn cần hết sức chú ý các điều kiện thực nghiệm mới cho kết quả chính xác. Trong thực tế để tạo phức hỗn hợp thường dùng: Các ion kim loại: Cu2+, Co2+, Ni2+, Hg2+, Fe3+, Ca2+. Phối tử Y đưa vào có thể là ion vô cơ như SCN, OH... hoặc hữu cơ như pyridin, diphenylcacbazon... . Chất cần xác định (X) có thể mang: tính acid như acid benzoic và dẫn xuất, acid salicylic và dẫn xuất, barbiturat.... tính base như alcaloid, các amin.... Xem 2 ví dụ cụ thể trong tài liệu. II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT ĐO QUANG: 2. Chiết cặp ion: Các chất hữu cơ thường mang tính acid base. Trong môi trường kiềm các chất acid mang điện tích âm A. Vì vậy để tạo ra cặp ion người ta cho vào đó một chất tạo ra ion dương K+ (gọi là chất tạo đối ion hoặc gọi tắt là đối ion). Nếu là chất có tính base thì trong môi trường acid sẽ mang điện tích dương BH+, ta sẽ đưa vào đó chất tạo đối ion A để tạo cặp ion BH+A. Trong phương pháp chiết đo quang các chất tạo đối ion là những chất màu, hấp thụ mạnh bức xạ ở vùng nhìn thấy, được dùng cho việc định lượng đo quang. Vì vậy còn được gọi là phương pháp chất màu (dye method). 2. Chiết cặp ion... Phương pháp chất màu base: Các chất màu base mang điện tích dương trong ddịch có pH thích hợp như: rodamin, aridin, lục malachit, lục brilian... tạo với các acid (điện tích âm) các cặp ion chiết được bằng dung môi hữu cơ. Bằng cách này có thể xác định được nhiều chất hoạt động bề mặt anion, dẫn xuất của acid benzoic, acid salicylic, phenol và dẫn xuất...(bảng 7.1) Ví dụ để xác định dẫn xuất nitrophenol bằng cách cho chất nghiên cứu với Rodamin 6R và đệm có pH 3- 4 lắc với benzen. Đo mật độ quang dịch chiết benzen ở 540- 560nm. Từ đồ thị D- C tính ra nồng độ của chất nghiên cứu. 2. Chiết cặp ion... Phương pháp chất màu acid: Các chất màu acid mang điện tích âm trong môi trường pH thích hợp (như nhóm sulfophtalein hay nhóm azoic) tạo với các chất mang điện tích dương như các alcaloid, base, hữu cơ tổng hợp những cặp ion ít tan trong nước, chiết được bằng các dung môi không phân cực (xem bảng 7.2)Loại chất màu này rất hay dùng trong kiểm nghiệm độc chất để xác định nhiều alcaloid và base tổng hợp. Trong một số trường hợp có thể xác định trực tiếp từ mẫu thử. Dung môi thường dùng là cloroform, dicloetylen và benzen.Ví dụ định lượng các base nitơ bậc bốn với xanh bromophenol (xem tài liệu) 2. Chiết cặp ion... Phương pháp chiết cặp ion nói chung không chọn lọc, các base nitơ gần nhau đều có thể tạo cặp ion ở cùng điều kiện, nhất là trong KNĐC, bên cạnh chất độc, trong mẫu thử còn có các sản phẩm chuyển hoá của nó rất gần nhau về cấu trúc. Xử lý mẫu thử trước khi chiết cặp ion: Trường hợp mẫu thử là huyết tương, nước tiểu hoặc mô (tissue) thì cần xử lý trước khi chiết cấp tốc cặp ion phục vụ cho cấp cứu ngộ độc. Cách xử lý cụ thể xem tài liệu 3. Chiết xuất dưới hợp thức: Dựa trên nguyên tắc là chiết một lần cặp ion với một lượng dung môi ít không lấy hết sản phẩm màu. Trong điều kiện này mật độ quang không chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất phân tích trong dung dịch mà cả hệ số phân bố của cặp ion giữa dung môi và nước. Đường chuẩn thu được trong trường hợp này với các alcaloid khác nhau sẽ có hệ số góc khác nhau. Vì vậy dựa vào đường chuẩn không chỉ để định lượng mà còn phân biệt được chúng. Phương pháp cũng có thể xác định hỗn hợp 2 chất cùng có thể tạo cặp ion với 1 chất màu. 