Bê sinh ra từ trứng được nuôi chín và thụ tinh ngoài cơ thể mẹ

Bê sinh ra từ trứng được nuôi chín và thụ tinh ngoài cơ thể mẹ 1 Giới thiệu Động vật nhai lại đầu tiên được tạo ra từ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) là một con bê đực sinh năm 1981 (Brackett, B.G et al, 1982). Các tế bào trứng của các loài động vật có vú có khả năng khôi phục sự phân bào giảm nhiễm từ giai đoạn dictyate (một phần của prophase-Pha trước) tới metaphase II khi chúng được lấy ra khỏi nang trứng và nuôi trong môi trường phù hợp. Hiện tượng này được gọi là quá trình nuôi chín in vitro do Pincus và Enzmann báo cáo từ 1935. Các tế bào trứng được nuôi chín in vitro (IVM) có thể phát triển thành phôi? nếu đem cấy truyền vào một bò cái đã được dẫn tinh trước đó, sau đó cấy trở lại vào một con nhận khác khi phôi đạt tới giai đoạn phôi nang, mặc dù đã có báo cáo rằng các tế bào trứng sau khi nuôi chín in vitro không thể tạo ra tiền nhân đực sau khi IVF và không thể tiếp tục phát triển thêm nữa. ở Nhật, con bê đầu tiên được tạo ra sau khi IVM và IVF vào năm 1985 (Hanada, A., Suzuki, T., Shioya, Y., 1986). Đây là một thành tựu rất đáng chú ý vì đã đưa ra được phương pháp tiến hành cụ thể, thu được kết quả trong cùng thời gian tạo được nhiều phôi và phôi có thể phát triển thành bê. Phương pháp này làm giảm giá thành rất nhiều trong công nghệ cấy truyền phôi. Để thu được các phôi nang bằng phương pháp không phẫu thuật, người ta dùng ống dẫn trứng thỏ làm nơi nuôi cấy tạm thời. Bây giờ mọi người đã biết các phôi có nguồn gốc từ các tế bào trứng bò sau khi IVM/ IVF, có thể phát triển thành phôi nang khi nuôi cấy trong môi trường TCM 199 có bổ sung huyết thanh bò. Mục đích chính của bài báo này là điểm lại kết quả của việc tiến hành tạo phôi từ tế bào trứng bò bằng phương pháp IVM/IVF tại Viện Chăn nuôi quốc gia (National Institute of Animal Industry - NIAI) của Nhật Bản. 2 Quy trình chung Buồng trứng bò được thu thập từ lò mổ địa phương, đặt trong nước muối sinh lý ấm có bổ sung 100 UI penicillin (Penicillin G Kali kết tinh, Meiji Conf. Co., Japan), 100 mg streptomycin/ml (streptomycin sulfate, Meiji Conf. Co.) và chuyển về phòng thí nghiệm của NIAI trong vòng 2 giờ. Dùng xơ-ranh với kim 18-G hút các tế bào trứng từ các nang trứng nhỏ (dưới 5mm). Dịch hút được cho vào môi trường PBS Dulbecco?s có bổ sung 3mg albumin huyết thanh bò/ml (Fraction V, Miles, Naperville, USA) và kháng sinh tố. Lựa chọn các tế bào trứng dựa trên độ dày mỏng và độ rắn chắc của các lớp tế bào cumulus bao xung quanh. Đem nuôi cấy trong 100 ml dung dịch có chứa 25mmol HEPES bufered TCM 199 (Gibco, Grand Island, USA) đã được bổ sung 10% huyết thanh bò và 0,002 AU FSH (Antrin, Denka Pharma. Co., Japan) và 1 mg estradiol/ml (17b-estradiol, Sigma Chem. Co., USA) dưới một lớp dầu phủ (Squibb và Sons Inc., USA) trong 20-22 giờ. Điều kiện không khí nuôi cấy gồm 5% CO2? và 95% không khí đã được làm ẩm ở 390C. Để tiến hành hoạt hoá, tinh trùng được giải đông và cho vào ống 10ml, sau đó trộn với 10ml Caff-BO (modified DM of Brackett and Oliphant, 1975) (Takahashi, Y. và Hanada, A., 1984) và 10 mmol Natri Caffein Benzoat), không bổ sung albumin huyết thanh bò.? Sau đó tinh trùng được đem ly tâm với tốc độ 500 G trong 5 phút, hút lấy phần nổi và cho vào dung dịch Caff-BO, ly tâm lại lần nữa và hút lấy phẩn nổi. Cục tinh trùng nổi được cho vào 0,5-1,0 ml Caff-BO và nồng độ tinh trùng được đếm và điều chỉnh trong khoảng 1x107 đến 2x107 tinh trùng/ml. Tinh trùng sau khi đã điều chỉnh pha loãng với BSA-BO-Hep (modified DM of Brackett and Oliphant, 1975) với 20 mg BSA tinh thể (Sigma Chem. Co., USA) và 5-10 ml heparin/ml (Novo Heparin, Novo Industry A/S, Denmark)) theo tỷ lệ 1:1. Tinh trùng (0,1ml) được phủ dầu mỏ lên trên và đem ủ trong 15 phút ở 390C trong điều kiện 5% CO2 và 95% không khí ẩm. Các tế bào trứng sau khi nuôi cấy được chuyển vào giọt tinh trùng để thụ tinh. Sau khi ủ hỗn hợp tinh trùng-tế bào trứng trong thời gian 4-6 giờ, các tế bào trứng này được chuyển vào môi trường nuôi cấy để phân chia và phát triển. Môi trường nuôi cấy bao gồm 25 mmol HEPES buffered TCM 199 có bổ sung 10% huyết thanh bò và các kháng thể. Nhặt một số tế bào trứng và loại bỏ tế bào cumulus, cho vào lam kính loại 4-wax-spot và trộn với axit alcohol-axetic để kiểm tra khả năng hoạt hoá của tinh trùng và khả năng tạo tiền nhân sau khi thụ tinh 10-18 giờ. Các tế bào trứng còn lại được nuôi cấy và kiểm tra? sự phân chia ở ngày thứ 3 hoặc thứ 4 (ngày 1 là ngày thụ tinh). Để kiểm tra, các lớp tế bào cumulus được loại bỏ bằng pipet một cách nhẹ nhàng. Các phôi có sự phân chia được nuôi cấy trong cùng một đĩa và có thể quan sát sự phát triển của phôi nang trong vòng 7-10 ngày. 3 Kết quả 3.1. Thu hoạch các buồng trứng ở lò mổ Các buồng trứng được chuyển về phòng thí nghiệm ở các điều kiện 40, 230 và 380C trong vòng 2-4 giờ sau khi gia súc chết. Các tế bào trứng từ buồng trứng để ở 40C cho thấy sự giảm sút đáng kể khả năng phát triển thành blastocyt sau khi tiến hành IVM/IVF. Nếu vận chuyển ở điều kiện 250C sẽ có ưu điểm hơn so với 380C, đó là tỷ lệ phát triển của phôi nang biến động từ 15,5% (37/239) tới 20,5% (39/190) (Tsukamoto, A. et al., 1989) (bảng 1 và 2) Bảng 1.? ảnh hưởng của nhiệt độ nước muối sinh lý sử dụng để vận chuyển buồng trứng tới sự phát triển thành phôi nang sau khi IVM/IVF Bò Nhiệt độ nước muối (0C) Số tế bào trứng sử dụng Tỷ lệ phân chia (%) Phôi nang (%) Toch 38 23 177 190 77,4 71,6 23 (13,0) 39 (20,5) 688 38 23 293 239 53,2 51,5 24 (8,2)a 37 (15,5)b a, b thể hiện sự sai khác rõ rệt (P<0,01),? c2-test Có thể vận chuyển buồng trứng về phòng thí nghiệm trong thời gian dài vì 16,0% (109/683) tế bào trứng thu được từ buồng trứng ở 200C trong vòng 8 giờ vẫn có thể phát triển thành phôi nang (Abe & Shioya, 1991, không xuất bản). Bảng 2.? ảnh hưởng của việc dùng nước muối sinh lý ở nhiệt độ thấp khi vận chuyển buồng trứng tới tỷ lệ phát triển thành phôi nang sau khi IVM/IVF Nhiệt độ nước muối (0C) Số tế bào trứng sử dụng Tỷ lệ phân chia (%) Số phôi nang và (%) 23 470 71,3a 102 (21,7)a 4 506 34,0b 33 (6,5)b a, b thể hiện sai khác rõ rệt (P<0,01) 3.2. Thu thập và lựa chọn tế bào trứng để nuôi chín 3.2.1. Thu thập tế bào trứng Mặc dù có tới 40 nang trứng nhỏ trên bề mặt một cặp buồng trứng nhưng dùng xơ-ranh và kim cũng chỉ hút được khoảng 20 tế bào. Chỉ có 1/3 số tế bào trứng thu được còn nguyên màng cumulus bao xung quanh và thích hợp cho IVM/IVF (Kurosaka, S. et al., 1987). Giai đoạn của chu kỳ động dục không ảnh hưởng tới số lượng tế bào trứng thu được và các tế bào trứng thu được từ các giai đoạn động dục khác nhau đều phát triển thành phôi nang sau khi IVM/IVF (Kurosaka, S. et al., 1987). Để thu thập tế bào trứng, có thể nghiền nhỏ hoặc cắt buồng trứng (Iwasaki, S. et al., 1987). Gần đây có? phương pháp mới để thu thập tế bào trứng: dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng, sau đó dùng một dụng cụ rất nhỏ (trông giống chiếc thìa) xúc tế bào trứng ra, phương pháp này giúp thu được nhiều tế bào trứng hơn (bảng 3). Cần phải nghiên cứu sâu hơn nữa để có thể thu thập và sử dụng được tất cả các tế bào trứng trên một buồng trứng. Bảng 3. Các phương pháp thu thập tế bào trứng từ nang trứng Phương pháp hút a) Phương pháp rạch b) Số lượng bò Số tế bào trứng IVF Số lượng bò Số tế bào trứng IVF 11 28 25 11,4 6,5 6,9 10 15 9 19,1 10,8 9,7 14 8 7,1 7,1 4 11 17,3 13,6 Tổng số 86 7,2 49 13,4 a) Kim 18G và xơ-ranh 5m -? b) Rạch nang trứng bằng dao, dùng? chiếc "thìa" nhỏ múc tất cả dịch và tế bào trứng trong nang trứng ra 3.2.2. Thu thập tế bào trứng để nuôi chín Dưới kính hiển vi soi nổi, phân loại tế bào trứng theo đặc điểm của lớp tế bào cumulus bao xung quanh. Loại A: tế bào trứng có đám tế bào cumulus chắc và dày đặc bao xung quanh. Loại B: trứng được tế bào cumulus bao bọc một phần. (Loại B?: trứng ?gần như trần trụi với một lớp mỏng tế bào cumulus hoặc còn sót lại dấu vết của cumulus). Loại C: tế bào trứng không có cumulus. Các tế bào loại A, B, B? và C đem nuôi chín, thụ tinh in vitro và nuôi cấy để phân chia. Nhận thấy đặc điểm của đám tế bào cumulus bao xung quanh có ảnh hưởng đến tỷ lệ phân chia của tế bào sau khi IVM/IVF (Shioya, Y., et al., 1988) (Bảng 4). Bảng 4. Khả năng phân chia của các tế bào trứng IVF theo sự phân loại dựa trên tính chất đám tế bào cumulus bao xung quanh Loại Số tế bào trứng phân chia/ số tế bào nuôi cấy (%) A, B B? C 232/364 (63,7)a 36/122 (29,5)b 28/158 (17,7)c a, b (P<0,01)và b,c (P<0,01) thể hiện sự sai khác rõ rệt Các tế bào loại A và B có thể phát triển thành phôi nang, còn các tế bào chỉ có dấu vết của cumulus bao xung quanh hoặc không có cumulus thì không thích hợp cho IVM/IVF vì chúng không thể phát triển thành phôi nang. 3.2.3. Nuôi chín các tế bào trứng Các tế bào sau khi nuôi cấy được thụ tinh in vitro vào thời điểm 16-28 giờ sau khi nuôi cấy chín. Không thể xảy ra sự thụ tinh sau khi nuôi cấy quá 24 giờ (Hirata, T. et al., 1989) (bảng 5). Bảng 5. ảnh hưởng của thời gian nuôi chín của tế bào tới tỷ lệ phát triển thành phôi nang Thời gian nuôi cấy (giờ) Số tế bào trứng được sử dụng Tỷ lệ phân chia (%) Phôi nang (%) 16 20 24 28 430 410 477 403 65,1 65,4 65,0 64,5 59 (13,7)a 62 (15,1)a 37 (7,8)b 16 (4,0)b a, b (P<0,01) và b (P<0,05) thể hiện sai khác rõ rệt Việc nuôi chín in vitro tế bào trứng cừu trong nang trứng có liên quan đến việc bổ sung hormone vào môi trường nuôi cấy (Moor, R. M. & Trouson, A. O., 1977). Chúng tôi nuôi cấy tế bào trứng trong môi trường TCM 199 có bổ sung 10% huyết thanh bê (CS), FSH (0,002 AU/ml) và 17b estradiol (1mg/ml) và trong môi trường có CS nhưng không có hormone để đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung hormone? tới quá trình IVM/IVF cũng như sự phát triển thành phôi nang. Chúng tôi đã chứng minh được rằng hormone không cần thiết cho khả năng phát triển của các tế bào trứng sau khi lấy khỏi các nang trứng nhỏ, mặc dù các tế bào cumulus đã được kích thích và mở rộng bằng hormone (Shioya, Y.Takada, N. & Tsukamoto, A, 1989) (bảng 6). Bảng 6. ảnh hưởng của gonadotropin và estradiol-17b? trong môi trường nuôi chín tới sự phát triển thành phôi nang sau khi IVM/IVF Bò Estradi ol (mg/ml) FSH (AU/ml) Tỷ lệ thụ tinh (%) Số tế bào trứng Tỷ lệ phân chia (%) Ph ôi nang (%) Sat 0 0 76, 52 40, 6 u 1 0,00 2 5 79, 4 12 9 4 53, 5 (11,5) 10 (7,8) 532 1 0 1 0 0,00 2 88, 1 86, 0 13 3 13 9 56, 4 63, 3 15 (11,3) 23 (16,5) Fukushima et al cũng báo cáo kết quả tương tự và đã có những con bê ra đời từ tế bào nuôi chín in vitro mà không cần hormone, sau đó được thụ tinh in vitro. Để tránh tác động của hormone có trong huyết thanh bê, nên nuôi tế bào trứng chín trong môi trường TCM 199 bổ sung albumin huyết thanh bò và không có hormone (Shioya, Y., Takada, N. & Tsukamoto, A., 1989). Các tế bào trứng sau khi IVM/IVF đã phát triển thành phôi nang. Tất cả các dữ kiện trên đây chỉ nhằm chứng minh rằng tế bào trứng bò nuôi cấy trong môi trường không có hormone có thể phát triển thành phôi nang sau khi IVM/IVF. 3.2.4. Hoạt hoá tinh trùng và thụ tinh Tinh trùng các loài động vật có vú không thể thâm nhập qua vùng trong suốt của tế bào trứng khi chưa được hoạt hoá với điều kiện giống như trong đường sinh dục con cái. Một vài phương pháp hoạt hoá tinh trùng in vitro để đạt được khả năng thụ thai ca xử lý ion canxi, ủ trước trong môi trường giàu BSA và xử lý heparin. Xử lý bằng ion: tinh trùng được rửa bằng môi trường Caff-BO (DM, có 10 mmol caffein Natri benzoat nhưng không bổ sung BSA), môi trường này đã được xử lý bằng 0,1 mmol ion trong 1 phút, sau đó pha loãng hai lần bằng BSA-BO (DM được cải tiến bằng 20 mg BSA/ml) để thụ tinh. Kết quả nâng cao được khả năng thụ tinh của tinh dịch bò. Nồng độ heparin trong tinh dịch bò được kiểm tra cho khả năng tăng tần suất thụ tinh in vitro. Cho 0-50 ml heparin vào 1 ml môi trường BSA-BO (Novo Heparin tiêm, Novo Ind. A/S, Denmark). Tinh dịch sau khi rửa bằng Caff-BO được pha loãng gấp đôi bằng BSA-BO có bổ sung heparin. Tinh trùng của cùng một bò đực thể hiện khả năng thụ tinh cao cả khi có hay không có heparin. Tinh trùng của hai bò đực có tỷ lệ thụ tinh thấp từ 13-55% và khi xử lý bằng heparin làm tăng tỷ lệ thụ tinh lên 90% (bảng 7). Do vậy xử lý heparin có tác dụng trong việc hoạt hoá tinh trùng sử dụng trong in vitro. Cho đến nay, đã kiểm tra tinh trùng của hơn 10 bò và chúng cho tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ phát triển phôi nang rất tốt. Bảng 7. ảnh hưởng của heparin trong môi trường BSA-BO tới tỷ lệ thụ tinh in vitro của tế bào trứng bò sau khi nuôi chín in vitro Heparin Tỷ lệ thụ tinh (%) (Số trường hợp thâm nhập vào tế bào trứng/ số trường hợp kiểm tra) (ml/ml) Bò đực Oo Bò đực Atsu Bò đực Satu 0 5 10 20 50 13,0 (3/23) 100,0 (21/21) 90,5 (19/21) 90,9 (20/22) 91,3 (21/23) 100,0 (11/11) 100,0 (14/14) 100,0 (13/13) 100,0 (14/14) 100,0 (14/14) 54,5 (12/22) 94,4 (17/18) 100,0 (10/10) 95,2 (20/21) 94,1 (16/17) Nồng độ tinh trùng trong môi trường thụ tinh là rất quan trọng để thu được tỷ lệ thụ tinh thích hợp. Số lượng tinh trùng trong môi trường thụ tinh được điều chỉnh tới 5-100 x 105/ml và quá trình IVM/IVF được tiến hành. Nồng độ tinh trùng thấp khoảng 5 x 105 cho kết quả thụ tinh và tỷ lệ phát triển phôi nang thấp hơn (bảng 8). Số lượng tinh trùng/ ml > 50 x 105/ml là đủ để có tỷ lệ phát triển phù hợp. Bảng 8.? ảnh hưởng của nồng độ tinh trùng tới tỷ lệ phát triển thành phôi nang sau khi IVM/IVF Bò đực Nồn g độ tinh trùng x104 Tỷ lệ thụ tinh (%) Tỷ lệ đa tinh trùng (%) Số tế bào trứng Tỷ lệ phân chia (%) Phô i nang (%) Toc h 25 250 500 1000 43, 6 94, 3 98, 9 98, 0,0 18, 0 34, 7 45, 15 3 15 9 27 1 29 8,5 42, 8 48, 3 60, 1 (0,7) 22 (13,8) 29 (10,7) 32 6 2 6 5 (10,8) Fuji 25 125 250 500 1000 49, 4 78, 6 94, 8 96, 7 95, 0 9,8 9,1 44, 0 56, 2 54, 4 22 6 30 7 27 8 31 7 17 3 10, 2 53, 7 62, 9 73, 2 71, 7 4 (1,8) 45 (14,7) 47 (16,9) 65 (20,5) 24 (13,9) 3.3.5. Sự phát triển thành phôi nang in vitro Sau khi được ủ với tinh trùng, tế bào trứng cần được chuyển môi trường để phát triển thành phôi nang. Nuôi cấy tế bào trứng đồng thời cùng tinh trùng trong 4-6 giờ (tuỳ theo bò đực cho tinh dịch). Môi trường TCM 199 có bổ sung huyết thanh bò cũng đóng góp cho sự phân chia của phôi nang. Những nguồn huyết thanh khác nhau (huyết thanh thai bê, huyết thanh bê, huyết thanh bò non và huyết thanh bò động dục) đều có thể sử dụng cho môi trường nuôi cấy, nhưng việc lựa chọn huyết thanh phù hợp là hết sức quan trọng. Trong hệ thống thí nghiệm IVM/IVF, các lớp tế bào cumulus bao xung quanh tế bào trứng được xem như là yếu tố tác động chính tới sự phát triển của phôi nang. Các tế bào cumulus tự động bong ra và chìm xuống đáy đĩa làm thành một lớp lá chắn tế bào. Để phân loại các ảnh hưởng của cumulus tới sự phát triển phôi nang, người ta dùng một loại pipet thuỷ tinh thích hợp? hút tách cumulus ra khỏi tế bào trứng sau khi tiến hành thụ tinh 8 giờ, các tế bào này được nuôi cấy trong môi trường có hoặc không có các tế bào biểu mô buồng trứng. Việc sử dụng các tế bào biểu mô buồng trứng làm tăng có hiệu quả tỷ lệ phát triển thành phôi nang từ các tế bào trứng đã bị tách cumulus, khác hẳn các tế bào trứng không có các lớp tế bào cumulus (Lie, B., Hiraizumi, S. & Shioya, Y., 1990) (bảng 9). Bảng 9.? ảnh hưởng của tế bào cumulus và các tế bào ống dẫn trứng tới tỷ lệ phát triển của phôi nang sau khi IVM/IVF Các điều kiện nuôi cấy Số phôi nang/số tế bào Các tế bào cumulus a) Các tế bào ống dẫn trứng b) trứng được sử dụng (%) Còn nguyên vẹn Còn nguyên vẹn Tách rời Tách rời + - + - 28/139 (20,1) 40/136 (29,4) 30/131 (22,9) 1/125 (0,8) a) Tách rời: Các lớp tế bào cumulus được tách rời khỏi tế bào trứng sau khi thụ tinh 8 giờ để làm cho tế bào trứng trở nên trần trụi. b) +: Các tế bào ống dẫn trứng của một bò mới rụng trứng được cho vào môi trường nuôi cấy (100.000 tế bào/ml). Tác động của các tế bào cumulus tới sự phát triển của các tế bào trứng khi IVM/IVF được lý giải là do sự có mặt của các yếu tố khuếch tán từ các tế bào trứng được nuôi cấy qua một phin lọc thẩm thấu đặt giữa chúng và các tế bào cumulus, và các tế bào trứng này có khả năng phát triển thành phôi nang. 3.3.6. Khả năng phát triển của phôi được tạo ra in vitro Bảng 10 cho thấy kết quả cấy truyền phôi từ các tế bào trứng sau khi IVM/IVF và khả năng ứng dụng của chúng. Các phôi nang thu được sau khi IVM/IVF có khả năng sinh sản sau khi truyền cấy (phương pháp không phẫu thuật) cho con nhận phôi. Bảng 10. Kết quả cấy truyền các phôi có nguồn gốc từ việc thụ tinh in vitro các tế bào trứng IVM với tinh trùng được xử lý heparin Cái Bò Ngày sau Phôi Kết quả nhận đực khi động dục a) Tuổi c) Cấy truyền d) 344 341 Ara Ara 7 (AI)b) 9 8 1 2 IVF-M, 40kg & AI-calf 345 365 346 370 373 372 626 374 356 355 Toch Fuji Toch Toch Toch Toch Toch Toch Toch Fuji 8 (AI) 7 (AI) 7 (AI) 8 8 8 7 8 8 7 7 8 8 9 9 9 9 8 8 8 8 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 IVF-M, 37kg & AI-calf IVF-M, 52kg & AI-calf - (động dục-84 ngày) IVF-M, 38kg & M, 27kg IVF-M, 25kg & M, 25kg - (động dục-27 ngày) - (động dục-47 ngày) IVF-M, 22kg & M, 29kg Sẩy thai (song thai, 196 ngày) IVF-M, 45kg Sẩy thai (156 ngày) a): Ngày động dục: ngày 0;?? b): AI; Con nhận đã được dẫn tinh;? ?c) Ngày thụ tinh in vitr ngày 1; d) Số phôi được cấy truyền; e) AI-calf: bê? có nguồn gốc do thụ tinh nhân tạo IVF-M; bê có nguồn gốc cấy truyền từ các phôi thụ tinh trong ống nghiệm. Các con số thể hiện khối lượng sơ sinh. Bảng 11. Thu tế bào trứng bằng "thìa" nhỏ và tỷ lệ phát triển của phôi nang sau IVF Số bò cái Số tế bào trứng dùng cho Số phôi nang IVF (trên 1 bò) (trên 1 bò) 22 19 34 12 24 30 278 (12,6) 328 (17,3) 521 (15,3) 204 (17,0) 382 (15,9) 513 (17,1) 44 (2,0) 58 (3,1) 92 (2,7) 51 (4,3) 43 (1,8) 57 (1,9) Hiện nay, từ một cặp buồng trứng lấy ở lò mổ về có thể tạo ra được 2- 3 phôi nang (bảng 11), và nếu truyền cấy cho bò nhận, có thể sinh được 1 hoặc 2 bê. Do đó cần cải tiến phương pháp IVM/IVF có hiệu quả hơn nữa để áp dụng tạo bê thương mại. Một ứng dụng quan trọng khác của IVM/IVF là nguồn cung cấp các tế bào trứng chín và các phôi với các giai đoạn phát triển xác định cho các công nghệ liên quan đến sinh sản. Có thể khẳng định rằng việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật IVM/IVF, một kỹ thuật mới, đã làm tăng năng suất di truyền./.