Báo cáo Flublok- Vắc xin chống cúm sản xuất từ tế bào côn trùng

Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok ĐẠI HỌC QUỐC GIATHÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC BÀI BÁO CÁO MÔN CÔN TRÙNG HỌC ỨNG DỤNG Đề tài: GVHD: TS. TRẦN PHI HÙNG SVTH : Hồ Thị Kim Lan MSSV : 0515283 Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 5 năm 2009 Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 1 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok MỤC LỤC 1. Tổng quan ............................................................................................ Trang 1 2. Giới thiệu về FluBlok.......................................................................... Trang 1 3. Giới thiệu về về Baculovirus .............................................................. Trang 2 4. Sản xuất vắc-xin chống cúm từ tế bào côn trùng là một phương thứ ưu thế .............................................................................. Trang 4 4.1. Sơ lược về quy trình sản xuất............................................................. Trang 4 4.1.1. Sản xuất vắc-xin từ phôi trứng.........................................................Trang 4 4.1.2. Sản xuất vắc-xin từ nuôi cấy tế bào động vật hữu nhũ ....................Trang 4 4.1.3. Sản xuất vắc-xin từ tế bào côn trùng ................................................Trang 5 4.2. So sáng tổng quan về lợi thế giữa quy trình sản xuất vắc-xin chống cúm từ tế bào côn trùng với các phương thức còn lại ...............Trang 5 5. Sản xuất FluBlok.................................................................................Trang 9 5.1. Tế bào nền côn trùng expresSF+........................................................Trang 9 5.1.1. Giới thiệu........................................................................................... Trang 9 5.1.2. Con đường xử lý tế bào ..................................................................... Trang 11 5.1.3. Sự dò tìm virus ngẫu nhiên................................................................Trang 11 5.1.3.1. Cách tiếp cận................................................................................. Trang 11 5.1.3.2. Lựa chọn các họ virus .................................................................... Trang 12 5.1.3.3. Lựa chọn các virus đích ................................................................. Trang 13 5.2 Các thử nghiệm lâm sàng ......................................................................Trang 13 6. Kết luận - Đề nghị ............................................................................... Trang 15 7. Tài liệu tham khảo .............................................................................. Trang 16 Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 2 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok FLUBLOK - VẮC-XIN CHỐNG CÚM SẢN XUẤT TỪ TẾ BÁO CÔN TRÙNG 1. Tổng quan Đối với các nhà sinh học nói riêng cũng như các nhà khoa học và tất cả nhân loại nói chung đã rất quen thuộc với hai chữ Côn Trùng. Ai cũng biết rằng Côn Trùng hiện nay là loài động vật có số lượng lớn nhất và đa dạng nhất trên Trái Đất. Tầm quan trọng của các loài Côn trùng không ai có thể phủ nhận được. Nói về Côn Trùng, Giáo sư Marcel Dicke, nhà côn trùng học, Đại học Wageningen tại miền nam Hà Lan cho biết: "Nếu không có côn trùng, thế giới sẽ không giống như những gì có ngày hôm nay, và thậm chí chúng ta cũng chẳng có dịp có mặt trên đời. Chúng ta hoàn toàn phụ thuộc vào đời sống của côn trùng, và nên cho mọi người thấy tầm quan trọng của chúng. Đó chính là mục đích của tuần lễ hội này. Bởi sự thực trái đất là hành tinh của côn trùng chứ không phải của con người". (Theo: nguoi/10977635/188/). Lời khẳng định của Giáo sư Marcel Dicke đã toát lên được tầm quan trọng của Côn trùng đối với sự sống trên Trái đất này. Thật vậy, chỉ có 1% còn lại là sâu bọ có hại, trong khi 99% côn trùng là có ích cho sự sinh tồn của loài người. Nhiều nghiên cứu từ côn trùng đã đem đến cho con người những ứng dụng mang tính thực tiễn và khoa học rất quý giá. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngoài những nghien cứu làm sao để Bảo tồn loài sinh vật quý giá này, thì con người đang càng ngày càng hướng đến việc nghiên cứu về các ứng dụng của côn trùng, để vừa có thể vừa thực hiện được mục đích bảo tồn, vừa đem đến cho con người những lợi ích to lớn từ loài động vật với số lượng cực lớn trong sinh giới. Công ty Protein Corp. (Mỹ) đã thử nghiệm thành công một loại vắc-xin mới chống cúm ở người, tạo ra từ các tế bào của côn trùng với tên gọi là FluBlOk (Theo: xin-chong-cum-tu-te-bao-con-trung.html) Phát hiện này có thể nói đã đem đến cho con người một niềm hy vọng rất lớn, một phương thức bảo vệ sức khỏe cho nhân loại, không những thế còn mang đến giá trị kinh tế lớn lao thu nhập được từ việc kinh doanh loại vắc-xin này. Bài báo cáo dưới đây xin được phép nói rõ hơn về quy trình sản xuất, các ưu điểm cũng như những vấn đề xung quanh việc Sản xuất FluBlOk - một vắc-xin chống cúm được sản xuất từ tế bào côn trùng. 2. Giới thiệu về FluBlok FluBlok là một ngưng kết tố hồng cầu (trivalent recombinant hemagglutinin - rHA) tái tổ hợp tam trị, được sản xuất từ các tế bào côn trùng thông qua việc sử dụng hệ thống biểu thức vector baculovirus (Baculovirus Expression Vector System Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 3 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok - BEVS) cung cấp một giải pháp hấp dẫn so với loại vắc-xin cúm bất hoạt tam trị (trivalent inactivated influenza vaccines - TIVs) sản xuất từ các tế bào trứng được dùng lúc bấy giờ. Quy trình công nghệ mới này đem một sự sản xuất vắc-xin an toàn, hiệu quả và nhanh chóng. FluBlok chứa đựng lượng HA cao hơn TIV gấp 3 lần và trong thành phần không còn chứa đựng Protein trứng hay những chất bảo quản trứng. Độ thuần khiết cao của sinh kháng thể cho phép một sự tác động ở liều bậc cao mà không có sự ảnh hưởng lớn của cái gọi là phản ứng phụ lên chủ thể con người. BEVS là một hệ thống sản xuất an toàn, hạn chế tốc độ phát triển của các sinh vậy không mong muốn trong quá trình sản xuất. (Theo: 4VVN4T3- 1&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C0000502 21&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=063e2de7599dd62efaf78f15c8 e4b4c1 - Cox MM, Hollister JR, Báo cáo FluBlok, a next generation influenza vaccine manufactured in insect cells, Biologicals (2009), doi:10.1016/j.biologicals.2009.02.014) 3. Giới thiệu về về Baculovirus Baculovirus thường được tìm thấy trong rau xanh, do đó nó trở thành một thành phần trong chế độ ăn uống lành mạnh của mỗi con người. Cái tên Baculovirus bắt nguồn từ chữ baculum trong tiếng Latinh - có nghĩa là hình que, mô tả hình dạng của virus. Baculovirus được xác định bởi một phạm vi hẹp trên sinh vật chủ - đối với các loài sâu bọ cánh vảy như Bướm - nơi mà chúng gây ra các bệnh chết người. Khi đó, những côn trùng bị nhiễm độc baculovirus sẽ gây biến tính cấu trúc keo, đặc biệt đối với các polyhedrin protein. Trong môi trường sống của virus, polyhedrin protein. Bảo vệ virus khỏi tia cực tím. Baculoviruses ( Tế bào côn trùng có thể thực hiện nhiều sửa đổi hợp lý đối với các hoạt động sinh học của các protein phức tạp như quá trình đường hóa, sự hình thành mối liên kết disulfua, và sự photphoryl hóa. Nhiều năm qua, hàng ngàn gen đã được tái bản thành công và nhanh chóng trong tế bào côn trùng. Với hệ thống sản xuất BEVS, protein có thể được sản xuất Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 4 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok trong tuần, thay vì trong tháng, trong năm; bởi vì vius (nói đúng hơn là các dòng gen của chính virus đó) được biến đổi về mặt di truyền để gây độc cho tế bào côn trùng. Kiểu gen của baculovirus tương đối nhỏ (khoảng 160 kb) và có thể được nhận dạng bởi các kiểu gen bị tiêu hủy hoặc bằng kỹ thuật giấy thấm Southern. Sau khi virus gây nhiễm độc tế bào côn trùng, tế bào sẽ được biến đổi trong một thiết bị sản xuất protein baculovirus trước khi chết. Những protein (dị dạng) khác nguồn gốc có thể gây chết tế bào trong phần đời ngắn ngủi còn lại trong vòng đời của chúng.Các protein liên quan được tạo ra dưới sự điều khiển của promoter polyhedrin - một trong những promoter mạnh nhất được biết đến. Các protein tế bào côn trùng sản xuất thường độc hại vì các tế bào này có khả năng thực hiện các sửa đổi và bổ sung phức tạp. (Theo: B Baculovirus Expression Vector System (BEVS) Hệ thống BEVS mang lại nhiều lợi thế, và đặc biệt tránh được sự tiếp xúc trực tiếp của con người với quy trình sản xuất. Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 5 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok Con người không tiếp xúc trực tiếp với quy trình sản xuất (Theo: biotechnologies.com/adx/aspx/adxGetMedia.aspx?DocID=701,686,650,26,12,2,1,D ocuments&MediaID=618&Filename=Robinson+-+NCNV+II+(2007).pdf) 4. Sản xuất vắc-xin chống cúm từ tế bào côn trùng là một phương thứ ưu thế Sản xuất vắc-xin từ phôi trứng Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 6 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok 4.1 Sơ lược về quy trình sản xuất ( 4.1.1 Sản xuất vắc-xin từ phôi trứng Tập hợp, thu nhặt trứng đã được thụ tinh => gây ảnh hưởng với vius cúm, ủ ở nhiệt độ 32-370C => quay ly tâm LS/HS, xác định bản chất của bệnh thông qua một sự phân tích chẩn đoán, sắc ký =>Xử lý - xử lý với Formal đehit 4.1.2 Sản xuất vắc-xin từ nuôi cấy tế bào động vật hữu nhũ Làm tan một lọ nhỏ trong WCB, phát triển tới vảy Mfg => gây ảnh hưởng với vius cúm, ấp trứng ở nhiệt độ 32-370C => => quay ly tâm LS/HS, xác định bản chất của bệnh thông qua một sự phân tích chẩn đoán, sắc ký => Xử lý với Formal đehit Tóm lại quy trình là: Chuẩn bị tế bào gốc => Gây ảnh hưởng và ủ bệnh => xóa dấu vết tế bào, làm sạch vius => vius bất hoạt 4.1.3 Sản xuất vắc-xin từ tế bào côn trùng Làm tan một lọ nhỏ trong dụng cụ WCB, phát triển tới vảy Mfg => gây ảnh hưởng với vius cúm, ấp trứng ở nhiệt độ 22-270C, MF/DF sắc ký =>Baculovirus bất hoạt. Tế bào côn trùng (Theo: biotechnologies.com/adx/aspx/ adxGetMedia.aspx?DocID=701 ,686,650,26,12,2,1,Documents &MediaID=618&Filename=Ro binson+- +NCNV+II+(2007).pdf) ( Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 7 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok 4.2 So sáng tổng quan về lợi thế giữa quy trình sản xuất vắc-xin chống cúm từ tế bào côn trùng với các phương thức còn lại Dây chuyền quy trình đơn giản, độ an toàn cao so với phương thức sản xuất từ trứng gà. Có thể điểu chỉnh được thời gian Không có sự thích nghi của các chủng virus mới trong các dòng tế bào Đối với côn trùng, quả trình chỉ đòi hỏi trình tự gen của các chủng Tránh sử dụng các virus còn sống Không còn RNA virus cúm Không có nguy cơ lây lan dịch bệnh Việc sản xuất cỏ thể chỉ cần 2 tháng từ khi đồng nhất hóa các trình tự gen Có thể nuôi cấy ở dạng huyền phù Phương thức tiếp cận một lần để sản xuất vắc-xin bệnh cúm Không gây nguy hiểm đối với nhân viên Giảm bớt các quá trình sản xuất phức tạp, giảm việc sử dụng các thiết bị dụng cụ phức tạp, từ đó giảm đáng kể chi phí các thiết bị cơ bản trong quá trình sản xuất. Tăng nhanh năng suất (Năng suất quá trình sản xuất cao hơn so với từ nuôi cấy mô tế bào động vật hữu nhũ) Việc tiếp cận phương thức sản xuất khép kín được tán thành (Theo: biotechnologies.com/adx/aspx/adxGetMedia.aspx?DocID=701,686,650,26,1 2,2,1,Documents&MediaID=618&Filename=Robinson+- +NCNV+II+(2007).pdf) Kết quả so sánh này cũng được thống nhất ở các báo cáo khoa học khác. Theo thì các baculovirus tái tổ hợp có thể bắt đầu sư dụng một cách nhanh chóng, không như các dòng tế bào động vật hữu nhũ khác, nghĩa là không cần một thời gian để lựa chọn và mở rộng trước khi bắt đầu. Năng suất của các protein tương tự cũng tương đối giống nhau và có thể đáp ứng được quy mô của nhu cầu thực tế. Cervarix ", Vacxin GlaxoSmithKline (GSK) mới cho vắc-xin phòng bệnh bại liệt ở người được sản xuất bằng cách sử dụng công nghệ baculovirus, như một ví dụ về văc-xin bệnh cúm của Protein Science's là FluBlOk chứa 3 protein ngưng kết tố hồng cầu (rHA) tái tổ hợp. Người ta chỉ ra rằng các tế bào côn trùng có những con đường chuyển hóa đường giống như con đường chuyển hóa đường của tế bào động vật có vú, do đó con đường chuyển hóa đường của vùng HA thì giống những văc-xin dẫn xuất của động vật hữu nhũ. Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 8 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok Con đường chuyển hóa đường của tế bào động vật có vú Theo: ( Con đường chuyển hóa đường của tế bào côn trùng Theo: ( Tế bào côn trùng có thể không bị nhiễm vius của tế bào động vật hữu nhũ, do đó hạn chế tối đa được công đoạn loại bỏ và phê chuẩn để lựa chọn vius, tăng mức độ an toàn của văc-xin thu được từ tế bào côn trùng, từ đó giảm đáng kể thời gian và chi phí để thực hiện các thử nghiệm lâm sàng. Thống kê các lợi thế từ việc sản xuất vắc-xin chống cúm từ tế bào côn trùng. Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 9 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok Sơ đồ biểu diễn lợi thế về tốc độ của quá trình sản xuất vắc-xin từ tế bào côn trùng (Novavax) - chỉ mất từ 10-12 tuần - so với các phương pháp truyền thống (traditional) phải mất 24 tuần. Mối tương quan về năng suất sản xuất vắc-xin từ 3 phương pháp: từ phôi trứng gà, tế bào động vật và từ tế bào côn trùng Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 10 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok Biểu đồ mô tả sự khác nhau về chi phí sản xuất giữa các phương pháp: từ phôi trứng (egg-based), tế bào động vật hữu nhũ (mamalian cell) và tế bào côn trùng (insect cell). Như vậy, chúng ta khẳng định sản xuất vắc-xin chống cúm từ tế bào côn trùng là một phương thức ưu thế. 5. Sản xuất FluBlok 5.1 Tế bào nền côn trùng expresSF+ 5.1.1 Giới thiệu Tập đoàn Protein Sciences sử dụng hệ thống BEVS để sản xuất protein tái tổ hợp từ dòng tế bào đặc trùng expresSF+ (SF+) của lớp côn trùng cánh vảy. Tế bào SF+ bắt nguồn từ dòng tế bào Sf9 được tạo ra nhờ phương pháp sinh sản vô tính bằng Spodoptera frugiperda => Sf9 Cells (Theo: %20NCNV%20II%20(2007).pdf) Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 11 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok hỗn hợp các dòng tế bào IPLB-Sf- 21AE bởi Cherry và Smith tại trường Đại học Texas A&M. Tại thời điểm dòng tế bào Sf9 đượcphát triển, dòng tế bào IPLB-Sf- 21AE vẫn được nuôi cấy liên tục kể từ sự cô lập của nó vào năm 1970, từ sự nuôi cấy sơ bộ của phôi thai thông thường và buồng trứng bình thường được mổ xẻ từ những buồng trứng nhộng của loài Spodoptera frugiperda. (Theo: 4VVN4T3- 1&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C0000502 21&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=063e2de7599dd62efaf78f15c8 e4b4c1) Một số đặc tính của các tế bào SF+ làm cho chúng cũng thích hợp để sử dụng như là các tế bào nền để sản xuất các dược phẩm sinh học bằng cách sử dụng hệ thống BEVS : 1. Các tế bào SF+ được phát triển trong sự trì hoãn trong các sản phẩm trung gian của tế bào tỷ trọng thấp lên tỷ trọng cao mà không cần sự kết lại thành nhóm. 2. Việc nuôi cấy tế bào SF+ thông thường tới 450L dưới điều kiện có cGMP và duy trì được tế bào thích hợp trong khoảng từ 18 đến 24 giờ đồng hồ. 3. Tăng đáng kể năng suất protein chứa đựng trong dòng tế bào SF+ so với dòng tế bào cha mẹ là Sf9. 4. Tế bào SF+ hỗ trợ sự tăng trưởng linh hoạt của baculovirus tái tổ hợp trong những thành phần có độ chuẩn cao của virus, do đó cho phép sự biểu hiện protein và sản xuất thành phần virus được thực hiện nhờ việc sử dụng dòng tế bào đơn có chất lượng và 5. những thuộc tính này chắc chắn có trên 50 con đường cho phép sự gìn giữ các thành phần hạt giống trở nên linh hoạt hơn đáng kể trong thời gian sản xuất có cGMP với quy mô lớn. Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 12 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok Hình ảnh biểu diễn sự thay đổi hình thái và phát triển của dòng tế bào SF+ trong thời gian nuôi cấy. (Theo : Các kiểm tra về chất lượng của dòng tế bào SF+ đã được mô tả trước đó và được thực hiện theo tài liệu hồ sơ Q5A của tổ chức Hội nghị Quốc tế (IHC) và Hiệp hội lương thực và dược phẩm thế giới (FDA) : « Số điểm để xét các thuộc tính của dòng tế bào được sử dụng trong sản xuất dược phẩm sinh học » năm 1993, và phác thảo chỉ đạo năm 2006 : « Thuộc tính và chất lượng của các tế bào nền và các vật liệu sinh học khác sử dụng trong sản xuất vắc-xin để phòng chống và điều trị dịch bệnh cúm ». Ngoài sự mô tả việc kiểm tra trong McPherson, những sự kiểm tra tiếp theo còn dựa vào sự đánh giá phê bình của FDA. 5.1.2 Con đường xử lý tế bào Sự dò tìm trực quan các thể hạt trong tế bào - các kiểu gen virus hoặc các bản sao yếu của virus trú ẩn nơi an toàn hầu như có khả năng trừ khi virus có thể được cảm ứng để tái sinh, cái mà đôi khi xảy ra như một trình tự của các tế bào đặc biệt. Để đánh dấu rằng đối với sự nhiễm trùng, tế bào SF+ an toàn, những tế bào từ ngân hàng tế bào SF+ kết thúc sự sản xuất bằng con đường (P>50) xử lý hóa học và ủ bệnh ở nhiệt độ cao để cảm ứng các tế bào thuộc giống cái để khảo sát bằng kính hiển vi điện tử quét (TEM). Để cảm ứng đặc biệt bằng con đường xử lý hóa học, các tế bào SF+ được sử lý với các hợp chất Halogen dạng vòng như 5-iododeoxyuridine (IdU) - hợp chất mà đã được đưa đến để hoạt hóa các bản sao virus trong nuôi cấy tế bào côn trùng và động vật hữu nhũ. Việc xử lý với IdU được thực hiện vì với sự có mặt của IdU, Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 13 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok tế bào phát triển trong 1 ngày. Và sau 1 ngày phục hồi, được phân tích bởi TEM. Phân tích việc xủ lý tế bào với chất hóa học đưa đến một phát hiện là không còn tồn tại thể virus và thể sống nào còn chứa trong bất kì tế bào nào trong 200 tế bào được kiểm tra. Một cú sốc về nhiệt độ cao là phương pháp độc lập thứ hai được sử dụng để cảm ứng đặc biệt tế bào SF+. Để đảm bảo rằng các tế bào thực sự bị gây stress bởi nhiệt độ cao, chúng tôi đã chọn những điều kiện kết nối trước để cảm ứng mạnh (gây sốc) các protein trong dòng tế bào liên quan tới tế bào Sf9. Trong các cú sốc nhiệt học đó, những protein được quan sát sẽ được cảm ứng, khi ủ bệnh trong thời gian từ 15 phút tới 1 giờ đồng hồ ở nhiệt độ lớn hơn 370C. Các tế bào SF+ sốc nhiệt đơn giản sẽ được ủ bệnh tế bào trong 45 phút ở nhiệt độ là 430C, và sau 1 ngày để phục hồi, sẽ được phân tích bằng kính hiển vi TEM giống như đối với con đường xử lý hóa học.Và việc phân tích việc xử lý tế bào bằng nhiệt cũng đưa đến một phát hiện là không còn tồn tại thể virus và thể sống nào còn chứa trong bất kì tế bào nào trong 200 tế bào được kiểm tra giống như trường hợp dùng con đường xử lý hóa học. Tuy nhiên có điều quan trọng cần lưu ý, hạn chế của cả hai phương pháp này là thiếu một sự điều khiển cảm ứng của tế bào côn trùng. Hiện tại , không có « vìrus có chứa RNA có thể chuyển các vật liệu dì truyền của nó thành dna trong tế bào ký chủ » giản tiếp ảnh hưởng đến tế bào Spodoptera frugiperda và phát triển thành các tế bào SF+ tiềm tàng, do đó, không khả thi. Và do đó, điều kiện xử lý được phát triển dựa trên các giả thuyết sử dụng sự nghiên cứu dòng tế bào động vật hữu nhũ như một nguyên tắc. 5.1.3 Sự dò tìm virus ngẫu nhiên 5.1.3.1 Cách tiếp cận Những virus sử dụng côn trùng như là loài vật chủ tự nhiên sơ khai được phân loại gồm có 17 họ và hơn 30 giống và sử dụng tất cả các hốc được biết đến cho sự mã hóa của gen, ngoại trừ dsDNA-RT. Tính đa dạng lớn giữa các virus gây bệnh côn trùng bị ghép với lỗ hổng lớn trong nghiên cứu khoa học của chúng ta, rằng virus tạo nên một thử thách môi trường - nơi mà phát triển dòng virus khảo sát để phát hiện sự hiện diện của virus gây bệnh côn trùng trong tế bào nền. Một cách lý tưởng, các thử nghiệm di truyền thì có khả năng phát hiện tất cả các loài virus gây bệnh côn trùng đã được biết đến bên trong họ virus đặc biệt là cần thiết. Gần đây, mồi PCR được thiết kế sao cho có khả năng phát hiện cả hai loài virus gây bệnh mụn dộp, bại liệt cũ và mới. Với sự phân tích này, các mồi PCR được thiết kế theo sự liên ứng - thoái hóa mồi đoạn oligonuclotide lai (CODEHOPs) cho sự tiếp cận phương pháp PCR. CODEHOP là phương pháp tiếp cận tốt để tận dụng các thuận lợi của các protein ngắn ( chứa 3 - 4 amino acid), sự bảo tồn cao các mô tip acid amin đã tìm thấy trong các protein liên quan được mã hóa bởi các loài virus trong cùng một họ. Dựa trên sự thành công trên các cách sử dụng khác của phương thức tiếp cận này, chúng tôi đã bắt đầu phát triển một khảo sát PCR cơ bản để sử Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 14 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok dụng chiến lược CODEHOP để bảo vệ dòng tế bào SF+ khỏi sự làm hỏng của các virus gây bệnh côn trùng. 5.1.3.2 Lựa chọn các họ virus Để tập trung thử nghiệm sự phát triển theo hướng các họ s gây bệnh côn trùng chứa đựng các loài virus tiềm ẩn nguy cơ cao làm hỏng các tế bào SF+, chúng tôi đánh giá các họ côn trùng có chứa virus được biết là ảnh hưởng tới loài côn trùng cảnh vảy. Bảng 1 là danh sách các họ virus được biết là chứa các virus gây bệnh côn trùng chỉ trừ các loài virus gây bệnh côn trùng là virus gây hại cây gỗ. (Trang bên) DANH SÁCH CÁC HỌ VIRUS CHỨA CÁC VIRUS GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STT Họ Kiểu Gen Thành phần loài Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 15 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok 1 Ascoviridae dsDNA Spodoptera frugiperda ascovirus 1a 2 Baculoviridae dsDNA AcMNPV Cydia pomonella granulovirus 3 Birnaviridae dsRNA Drosophila X virus 4 Dicistroviridae ssRNA(+) Cricket paralysis virus; Infectious flacherie virus 5 Iridoviridae dsDNA Invertebrate iridescent virus 6; Invertebrate iridescent virus 3 6 Metaviridae ssRNA- RT Saccharomyces cerevisiae Ty3 virus; Drosophila melanogaster gypsy virus; Ascaris lumbricoides tas virus 7 Nodaviridae ssRNA(+) Nodamura virus 8 Parvoviridae ssDNA Junonia coenia densovirus; Bombyx mori densovirus; Aedes aegypti densovirus; Periplaneta fuliginosa densovirus 9 Polydnaviridae dsDNA Campoletis sonorensis ichnovirus; Cotesia melanoscela bracovirus 10 Poxviridae dsDNA Menontha melontha entomopoxvirus; Amssacta moorei entomopoxvirus; Chironomis luridis entomopoxvirus 11 Pseudoviridae ssRNA(+) Drosophila melanogaster copia virus 12 Reoviridae dsRNA Cypovirus 1; Idnoreovirus 13 Tetraviridae ssRNA(+) Nudaurelia capensis b virus; Nudaurelia capensis u virus Bảng 1: Danh sách các họ virus chứa các virus gây bệnh côn trùng Dựa vào sự phân tích này chúng tôi loại trừ họ Dicistoviridae phải chịu sự vắng mặt của một virus gây bệnh côn trùng cảnh vảy được biết lây lan nhanh cũng như họ Birnaviridae, mà chứa đựng một giống đơn gồm có một loài virut - Drosophila X virus. Cũng loại trừ luôn hai họ Reoviridae và Polydnaviridae, cả hai trong số đó bao gồm những virus mang thông tin di truyền hạn chế. Cuối cùng, những sự phân tích những virut thuộc về những họ Metaviridae và Pseudoviridae cũng được loại trừ vì mối quan hệ họ hàng của chúng, vì các tế bào côn trùng đã được kệt luận là một nguồn tài nguyên phong phú. Mục tiêu bảo tồn các vùng xác định trong protein mã hóa bởi các thành viên trong thành phần các họ virus này gần như có mặt trong kiểu gen tế bào SF+, và vì bản chất của retroelements, một kết quả tích cực từ phương pháp PCR không nhất thiết chỉ ra một sự lây nhiễm đại diện có mặt. Ngoài ra, các thử nghiệm cho các đại diện này được thực hiện bằng phương pháp phân tích PERT hoặc F-PBERT, do đó đã xác nhận sự có mặt của hoạt động phiên mã ngược, trong sự nuôi cấy bề mặt tế bào SF+, bao gồm sự có mặt của retroelement. Tuy nhiên, kết thúc quá trình sản xuất tế bào đã được xác định không Hồ Thị Kim Lan - 0515283 Trang 16 29/5/2009 Côn Trùng Học Ứng Dụng Vắc - xin FluBlok phải. để chứa đựng những hạt retrovirus lây nhiễm khi được kiểm tra trong phương pháp phân tích nuôi cấy tế bào. 5.1.3.3 Lựa chọn các virus đích Các protein virus đích thiết kế các CODEHOPs đã được lựa chọn bằng cách thực hiện một cách có hệ thống việc tự điều tra của các thông tin di truyền sẵn có cho các loài vi-rút trong mỗi họ. Tiêu chí để lựa chọn chuỗi protein đích cho thiết kế mồi dựa trên: 1. Số lượng các loài virus trong cùng một họ thì giúp cho các trình tự protein đích có khả năng. 2. Khả năng nhận dạng việc bảo tồn acid amin trong các trình tự có thể sắp xếp thành hàng. CÁC PROTEIN VIRUS ĐÍCH DẠNG CODEHOP STT Họ virus Protein đích Số tương ứng 1 Ascoviridae Major capsid protein CAF05815 2 Iridoviridae Major capsid protein Q05815 3 Nodaviridae RNA dependent RNA polymerase ABS29339 4 Parvoviridae Non-structural protein 1 NP051020 5 Poxviridae