Bài giảng Ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp - Chương 2: Ứng dụng công nghệ sinh học trong trồng trọt - Bài 3: Các hướng chính trong tạo giống thực vật chuyển Gen

BÀI 3 CÁC HƯỚNG CHÍNH TRONG TẠO GIỐNG THỰC VẬT CHUYỂN GEN I. CÂY TRỒNG KHÁNG SÂU Gen tiền độc tố kháng sâu do VK Bacillus thuringiensis sinh ra Chất kìm hãm α-amylaza Chất kìm hãm proteaza => Các chất này ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa thức ăn của sâu. 1. Tiền độc tố BT BT là một chế phẩm an toàn để bảo vệ cây do nó không tồn tại bền vững trong môi trường và không độc đối với ĐV có vú. Một số loài sâu ăn các mô bên trong cây nên không bị kìm hãm bởi các chế phẩm BT => Đưa gen độc tố BT vào biểu hiện trong cây và tổng hợp dạng hoạt động độc tố này với hàm lượng vừa đủ. Cách tiến hành: Xác định trình tự tối thiểu mã hóa hoạt tính độc (646 aa đầu tiên đầu N của tiền độc tố 1.156aa) Cắt ngắn gen sao cho chỉ phần đầu N tiền độc tố được tạo ra và chèn một promoto thực vật mạnh để điều khiển sự biểu hiện gen 2. Chất kìm hãm proteaza Một số lòai TV có các cơ chế bảo vệ trước sâu bệnh nhưng không thật sự hiệu quả. Phân lập gen proteaza thực vật quy định chất kìm hảm proteaza và một protor mạnh, sau đó đưa vào tế bào thực vật để tạo thành cây chuyển gen có khả năng sinh tổng hợp chất kìm hãm proteaza đủ cao để giảm sự phá hoại của sâu bệnh. Ví dụ: Đưa gen chất kìm hãm proteaza khoai tây II vào đã tạo cho cây lúa khả năng chống sâu đục thân hồng (Sesamia inferens): tạo lỗ hổng trong thân, bông lúa chết, không có hạt. 3. Chất kìm hãm α-amilaza Sự sinh trưởng của ấu trùng bọ vòi voi đậu bò (Callosobruchus maculatus) và bọ vòi voi đậu azuki (C.chinensis) bị kìm hãm khi trong khẩu phần ăn có đậu cove. Do trong đậu cove có mặt các chất kìm hãm α-amilaza. Tiến hành phân lập gen mã hóa chất kìm hãm α-amilaza và đặt dưới sự kiểm soát của một promotor mạnh đặc hiệu và biến nạp vào cây đậu Hà Lan. II. CÂY TRỒNG KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ Nguyên tắc chung là phải tìm được gen kháng lại cơ chế gây hại của thuốc trừ cỏ: Nâng cao hoạt tính của các enzyme bị hại do thuốc trừ cỏ; Tạo ra các enyme đột biến không bị ảnh hưởng của thuốc trừ cỏ; Tạo các enzyme làm mất tính độc của thuốc trừ cỏ. Ví dụ: Thuốc diệt cỏ kìm hãm quang hợp Bromoxynil Đưa gen mã hóa enzyme nitrilaza (phân lập từ VK đất Klebiella ozaenae) có thể bất hoạt bromoxynil trước khi nó hoạt động III. CÂY TRỒNG KHÁNG VIRUS Có nhiều hướng tạo cây kháng bệnh virus bằng kỹ thuật chuyển gen: Chuyển gen mã hoá cho protein vỏ; Chuyển gen tạo các ribozyme (enzyme phân giải virus); Chuyển các gen đối mã với RNA của virus. 1. Bảo vệ qua trung gian vỏ virus Protein vỏ của virus khi được tổng hợp trong cây chuyển gen có khả năng làm giảm sự gây nhiễm và lan tỏa một cách có hệ thống của virus đó (đôi khi cho tính kháng phổ rộng với các virus không liên quan). Cơ chế chính xác hiện nay chưa được biết rõ. 2. Bảo vệ bằng biểu hiện các gen khác Dùng protein thực vật kháng virus Ví dụ: Cỏ thương lục (Phytolacca americana) có 3 protein kháng virus: PAP: có ở lá mùa xuân PAP II: có ở lá mùa hè PAP-S: có ở hạt Đây là các protein bất hoạt ribosome loại bỏ gốc adenin đặc hiệu từ rARN của tiểu đơn vị 60S. IV. TẠO GIỐNG HOA CÓ KIỂU HÌNH VÀ MÀU SẮC MỚI Việc chuyển gen tạo ra giống hoa mới là một hướng đi đầy triển vọng vì cây hoa không phải là cây thực phẩm, việc sử dụng sản phẩm chuyển gen khá thuận lợi. Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, là dạng phổ biến nhất của chất màu ở hoa. Màu sắc khác nhau của hoa có thể được tạo thành bằng cách thay đổi gen của các enzyme trong con đường sinh tổng hợp anthocyanin. Đối tượng: hoa hồng, cẩm chướng, tulyp và cúc V. CÂY KHÁNG NẤM VÀ VI KHUẨN Dạng dự trữ liên hợp của acid salixylic Acid salixylic cảm ứng Các protein liên quan phát sinh bệnh (PR) Kháng tác nhân gây bệnh nấm hoặc vi khuẩn Ví dụ 1: Nồng độ Chitinaza cao Cây chuyển gen biểu hiện nồng độ chitinaza cao có khả năng thủy phân liên kết β-1,4 của chitin N-axetyl-D-glucosamin: thành phần chủ yếu của vách tế bào nấm. Ví dụ 2: Gen NPR1 Gen NPR1 là một protein điều hòa chủ sự biểu hiện các gen PR. Ở Arabidopsis thaliana việc biểu hiện quá mức gen NPR1 có thể dẫn đến sự tạo thành tính kháng bệnh phổ rộng với cả nấm và vi khuẩn. Ví dụ 3: Acid salixylic Sản xuất vượt mức acid salixylic Cách tiến hành: Tách các gen mã hóa enzyme isochorismat synthaza và isochorismat pyruvat lyaza. Dung hợp các gen này vào trình tự đích của DNA. VI. CÂY CHỐNG CHỊU STRESS VÀ SỰ GIÀ HÓA Hậu quả của stress sinh lý là sản xuất ra các gốc oxy => Cây có khả năng chống chịu với các gốc oxy sẽ có khả năng chịu được các dạng stress khác nhau 1. Stress oxy hóa Tác nhân gây stress: muối, hạn, đóng băng, ozon, SO2 . Hậu quả: tạo thành oxy phản ứng (phá hủy màng, cấu trúc liên kết màng, các đại phân tử…) chủ yếu là anion superoxid Ví dụ 1: Gen superoxit diamutaza O2- superoxit dismutaza H2O2 Catalaza H2O + O2 Tiến hành chuyển gen superoxit dismutaza vào cây thuốc lá tăng sức chống chịu với stress (cường độ chiếu sáng cao, ozon..) Ưu điểm: Tăng tính kháng với thuốc diệt cỏ Methyl viologen (paraquat) Kháng với stress ánh sáng Duy trì chất lượng hoa cắt trong quá trình vận chuyển Ví dụ 2: Tăng hàm lượng glutathion Tăng hàm lượng glutathion đã oxy hóa trong cây. Chuyển gen mã hóa enzyme có họat tính glutathion S-transferaza và glutathion peroxidaza vào cây thuốc lá => chịu stress với muối và giá lạnh tốt hơn 2. Stress muối Để sống sót trong điều kiện hạn hán hay nồng độ muối cao một số loài TV có khả năng tổng hợp các chất không độc có phân tử lượng thấp - chất chống thẩm thấu (đường, prolin, hợp chất amoni bậc 4..) Ví dụ 1: Tổng hợp betain Betain là chất chống thẩm thấu hiệu quả cao Khoai tây, lúa, cà chua lại không tích tụ betain => Đưa các enzyme sinh tổng hợp betain từ cholin: - Cholin mono-oxygenaza (CMO) - Betain aldehyde dehydrogenaza (BADH) Ví dụ 2: Cô lập Na+ trong không bào Sản xuất vượt mức gen mã hóa protein kênh trái chiều Na+/H+ của A.thaliana giúp cây có khả năng chịu được nồng độ muối cao. Đã thực hiện thành công đối với cây khoai tây, cà chua mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. 3. Chín quả và héo cây Đây là hiện tượng lão hóa bình thường ở thực vật. Tạo được cây cà chua Flavr Savr bằng kỹ thuật ức chế bằng đối mã. Làm chậm quá trình chín quả, héo hoa bằng cách ức chế sự tạo thành Ethylen Ví dụ 1: Ức chế đối mã (antisense inhibition) Trong caây caø chua Flavr Savr moät phaàn gen maõ hoaù toång hôïp polygalacturonase bò ñaûo vaø gaén laïi sau ñoaïn promotor taïo neân moät söï phieân maõ mRNA ñoái. RNA naøy khoâng theå phieân maõ toång hôïp protein ñöôïc. Hôn nöõa noù coøn lai vôùi caùc mRNA thuaän laøm cho caùc mRNA ñoù khoâng ñi ñeán ñöôïc ribosome ñeå dòch maõ. Do ñoù quaû caø chua seõ chöùa ít polygalacturonase hôn neân laâu bò thoái hôn caø chua bình thöôøng vì enzyme naøy xuùc taùc cho quaù trình phaân huyû maøng teá baøo ôû quaû laøm quaû bò nhuõn. Ví dụ 2: Ethylen Ethylen cảm ứng biểu hiện một số gen tham gia làm chín, già quả và héo hoa. Ức chế sự tạo thành ethylen VII. CẢI BIẾN HÀM LƯỢNG CHẤT DINH DƯỠNG CỦA CÂY Cải biến thành phần acid amin của một số protein dự trữ ở hạt (ngô, đậu) Cải biến thành phần acid béo 1. Acid amin Giá trị dinh dưỡng của một số protein dự trữ bị hạn chế do thiếu một số acid amin (lysin, methyonin) Cây đậu lupin chuyển gen làm thức ăn cho động vật: có gen biểu hiện albumin hạt hướng dương (có a.a methionin và cystein) Tăng sản xuất lysin ở cây chuyển gen bằng cách điều hòa con đường sinh tổng hợp lysin 2. Lipid Sản xuất bơ và thực phẩm đòi hỏi hàm lượng stearate cao. Cải dầu chuyển gen có bản sao đối nghĩa của stearat desaturaza kìm hãm sự khử bão hòa acid stearic thành acid oleic. 3. Vitamin Bổ sung hằng ngày vit E làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và ung thư Vitamin E thiên nhiên là một đồng phân duy nhất của d-alpha tocopherol. Có 4 loại tocopherol là alpha, beta, gamma và delta, nhưng alpha là dạng chính (Cũng là vitamin E thiên nhiên) tồn tại trong cơ thể, có tác dụng cao nhất. Cải biến cây sinh phần trăm α-tocopherol cao hơn γ-tocopherol. Phân lập gen γ-tocopherol methyltransferase từ cây Arabidopsis. Cây chuyển gen có nồng độ α-tocopherol cao hơn cây bình thường 80 lần