Bài giảng môn Giống cây trồng

cӫa hạt phҩn trên môi trѭӡng vô trùng. Sau đó cho chúng thụ tinh, phôi hình thành sẽ đѭợc nuôi cҩy ngay trên môi trѭӡng vô trùng. Công việc nói chung gồm các bѭớc sau: - Kích thích hạt phҩn nҧy mầm. - Kích thích sinh trѭӣng cӫa ống phҩn. - Nuôi noãn và cho noãn thụ tinh. - Nuôi hợp tử thành phôi và hạt. 58 Phѭơng pháp này đã thu đѭợc nhiều kết quҧ, đặc biệt ӣ một số chi thực vật cӫa các họ papaver eae, caryophyll eae và solan eae. Gần đây, cũng thu đѭợc một số kết quҧ trên họ hoà thҧo: lai noãn đại mạch (hordeum) với phҩn cӫa mạch đen (Secale) và cӫa lúa mì (Triticum). *. Nuôi cҩy phôi invitro Trong quá trình lai xa (khác loài, khác chi) thѭӡng xҧy ra hiện tѭợng bҩt hợp giữa phôi và nội nhũ. Kết quҧ thụ tinh có thể tạo thành hợp tử và phát triển thành phôi nhѭng phôi không sống đѭợc. Trong trѭӡng hợp này, nhӡ kỹ thuật nuôi cҩy invitro có thể nuôi cҩy phôi tách rӡi để cӭu sống chúng. Kết quҧ thu đѭợc con lai xa. Kỹ thuật này còn đѭợc gọi là kỹ thuật nuôi cҩy cӭu phôi rҩt hiệu quҧ cho những cặp lai xa phӭc tạp. Bố x Mẹ (xa nhau trong loài) F1 bҩt dục (tạo phôi nhѭng không sống đѭợc) Phân lập phôi non nuôi cҩy invitro Cây con khoẻ mạnh Để kỹ thuật nuôi cӭu phôi thành công rҩt cần quan tâm chĕm sóc cây mẹ vì cây mẹ quyết định sӭc sống cӫa phôi. Môi trѭӡng dinh dѭỡng để nuôi cҩy phôi cũng là những môi trѭӡng dinh dѭỡng đặc hiệu cần đѭợc nghiên cӭu tỉ mỉ riêng cho từng đối tѭợng. Nồng độ cao kali trong môi trѭӡng nuôi cҩy có tác dụng kích thích phôi phát triển, nguồn nitơ thѭӡng dùng các muối amon cӫa các axit hữu cơ: amoni malat, xitrat hoặc glutamat. 4.3.7. Công nghệ tế bào trong bảo quản nguồn gen Trong công tác giống, việc duy trì nguồn tài nguyên di truyền thực vật có vai trò vô cùng quan trọng làm cơ sӣ cho việc khai thác, sử dụng cho các công việc trѭớc mắt cũng nhѭ trong tѭơng lai. Vì thế, công việc bҧo quҧn nguồn gen thực vật là một công việc không thể thiếu trong công tác giống. Có hai phѭơng thӭc bҧo quҧn nguồn gen cây trồng: bҧo quҧn In-situ và bҧo quҧn Ex-situ. Bҧo quҧn In-situ là bҧo quҧn tại chỗ, cây đѭợc duy trì tại điều kiện sinh thái tự nhiên cӫa chúng. Bҧo quҧn Ex-situ là bҧo quҧn các mẫu trong điều kiện nhân tạo tối ѭu hay nói cách khác, các mẫu đѭợc thu gom từ nơi xuҩt xӭ và đem bҧo quҧn cҩt giữ hoặc trồng trọt tại các vѭӡn mẫu. Bҧo quҧn Ex-situ có các hình thӭc sau: - Bҧo quҧn trên vѭӡn ѭơm (field genebank); - Bҧo quҧn hạt trong kho lạnh (seed genebank); - Bҧo quҧn invitro (invitro genebank); - Bҧo quҧn ADN. Trong bốn hình thӭc đó, hình thӭc bҧo quҧn invitro có vai trò quan trọng vì bҧo quҧn trong một không gian hẹp nhѭng có thể lѭu giữ đѭợc khối lѭợng lớn cá thể, điều kiện bҧo quҧn hoàn toàn chӫ động và là biện pháp có hiệu quҧ đối với các cây trồng nhân vô tính và hạt cây dễ mҩt sӭc nҧy mầm ӣ nhiệt độ và độ ẩm thҩp. 59 Có hai phѭơng pháp bҧo quҧn in vitro: nuôi cҩy bҧo quҧn (bҧo quҧn sinh trѭӣng tối thiểu) và bҧo quҧn đông khô (bҧo quҧn ngừng sinh trѭӣng tạm thӡi). +. Phѭѫng pháp bҧo quҧn sinh trѭӣng tӕi thiểu Phѭơng pháp này áp dụng cho các cây con hoàn chỉnh, các cây nhân giống vô tính (chuối, dӭa, khoai tây, khoai lang, ...). Mẫu đѭa vào bҧo quҧn thѭӡng ӣ các dạng phôi, chồi, mầm, cây con. Mẫu phҧi đҧm bҧo sạch bệnh. Trong quá trình bҧo quҧn, mẫu đѭợc đặt trong điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và chế độ dinh dѭỡng sao cho tốc độ sinh trѭӣng cӫa chúng bị ӭc chế và giҧm tới 15 - 20 lần so với tốc độ sinh trѭӣng trong điều kiện bình thѭӡng. Các nhân tố thѭӡng dùng để ӭc chế sinh trѭӣng là: - Nhiệt độ bҧo quҧn thѭӡng 6 - 180C; - Môi trѭӡng có bổ sung các chҩt ӭc chế sinh trѭӣng (axit absisic, Clo Cholin Clorit: CCC); - Các chҩt làm tĕng áp xuҩt thẩm thҩu cӫa môi trѭӡng và giҧm cung cҩp oxi (manitol, dầu phӫ); - Môi trѭӡng nghèo dinh dѭỡng. +. Phѭѫng pháp bҧo quҧn ngӯng sinh trѭӣng tҥm thӡi Phѭơng pháp này chӫ yếu áp dụng cho các loại cây có hạt dễ mҩt sӭc nҧy mầm khi bҧo quҧn trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thҩp. Mẫu thѭӡng dùng là: phôi, mô sẹo, các mô nuôi cҩy, ... Mẫu đѭợc xử lý trѭớc khi đѭa vào bҧo quҧn lâu dài: xử lý dung dịch 5 - 10% prolin và manitol 3 - 6%, bổ sung chҩt chống đông: dung dịch DMSO 1M có thêm glycerol 1M và đѭӡng sacarozơ 2M. Bҧo quҧn mẫu ӣ nhiệt độ - 1960C. Các quá trình trao đổi chҩt sinh trѭӣng đều ngừng. Có thể bҧo quҧn mẫu dài tới 20 - 30 nĕm. Mẫu sau thӡi gian bҧo quҧn khi lҩy ra đѭợc phá bĕng ӣ nhiệt độ 400C. Mẫu đѭợc phục hồi sinh trѭӣng và tiếp tục nuôi cҩy để tạo cây hoàn chỉnh. 4.4. Công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng 4.4.1. Giới thiệu chung Kỹ thuật di truyền (genetic engineering) hoặc công nghệ gen (gen technology) là kỹ thuật cốt lõi cӫa công nghệ sinh học hiện đại đѭợc ra đӡi kể từ nĕm 1977, khi con ngѭӡi tạo ra phân tử ADN tái tổ hợp đầu tiên. Công nghệ gen bao gồm các kỹ thuật trên axit nucleic nhằm nghiên cӭu cҩu trúc cӫa gen, điều chỉnh và biến đổi gen, tách, tổng hợp và chuyển các gen mong muốn vào các tế bào sinh vật chӫ mới tạo ra các cơ thể mới, sinh vật mới mang đặc tính mới đáp ӭng yêu cầu cӫa con ngѭӡi. Các kỹ thuật chӫ yếu cӫa công nghệ gen bao gồm: kỹ thuật tách chiết gen, nhân dòng gen, xác định trình tự gen, chuyển nạp gen, theo dõi sự hiện diện, hoạt động và biểu hiện cӫa gen. Công nghệ gen sẽ mӣ ra một giai đoạn mới mang tính đột phá trong lĩnh vực nghiên cӭu và áp dụng sinh học nói chung và trong công tác giống cây trồng nói riêng. Trong lĩnh vực giống cây trồng, công nghệ gen cho phép: - Nắm đѭợc cҩu trúc bộ genom cӫa đối tѭợng thực vật nghiên cӭu về số lѭợng gen, trình tự nucleotit cӫa gen, chӭc nĕng cӫa gen, sự tѭơng tác hoạt động giữa các gen, ... Đây là nền tҧng quan trọng cho công tác giống cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật cho phép định hѭớng các chѭơng trình tạo giống một cách chuẩn xác và hiệu quҧ (chọn lọc bố mẹ, chọn lọc con lai, chọn lọc các cá thể ѭu tú). Đã công bố bộ genom cӫa lúa Indica bao gồm từ 45.000 - 56.000 gen, lúa Japonica từ 32.000 - 50.000 gen (nĕm 2002). 60 - Cho phép xác định đѭợc các gen mang đặc tính mong muốn, có thể cҧi biến, nhân và tổng hợp nhân tạo chúng, chuyển nạp các gen này vào đối tѭợng nghiên cӭu tạo nên giống mới có đặc tính định hѭớng, rút ngắn đѭợc thӡi gian chọn tạo. - Qua các chỉ thị phân tử, cho phép phát hiện và theo dõi sự hiện diện cӫa gen mong muốn và sự di truyền cӫa chúng qua các thế hệ, qua đó trợ giúp đắc lực, chính xác cho công tác chọn tạo giống. - Cho phép đánh giá sự đa dạng sinh học cӫa sinh vật ӣ mӭc phân tử, đѭa ra những phѭơng pháp phân loại mới, mối quan hệ họ hàng giữa các cá thể nghiên cӭu làm cơ sӣ cho các phѭơng pháp lai tạo giống. 4.4.2. Kỹ thuật gen trong phương pháp chọn tạo giống Để đѭa đѭợc những gen mong muốn vào thực vật, trѭớc kia ngѭӡi ta thѭӡng sử dụng phѭơng pháp cổ truyền là phѭơng pháp lai hữu tính giữa hai dòng mang gen mong muốn sau đó lặp lại bằng cách lai phục hồi giữa con lai và một trong hai bố mẹ chọn lọc các con lai tạo ra cho đến khi cây thu đѭợc mang những đặc tính mong muốn. Công việc này đòi hỏi nhiều thӡi gian công sӭc và trong nhiều trѭӡng hợp cây lai thu đѭợc có kèm theo cҧ đặc tính không mong muốn. Công nghệ gen cho phép những nhà di truyền và chọn giống thực vật xác định và thiết kế đѭợc các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn (kể cҧ các gen có nguồn từ các sinh vật khác loài) rồi chuyển các gen này vào các giống thực vật đang sử dụng. Tính tѭơng hợp về giới tính không phҧi đặt ra, quá trình tạo giống sẽ nhanh hơn, định hѭớng cụ thể hơn, tạo ra các giống mới mang những đặc tính chѭa hề có. Công nghệ gen sẽ dẫn đến những tiến bộ không lѭӡng trѭớc đѭợc trong công tác giống cây trồng. Để chuyển gen vào thực vật, các nhà nghiên cӭu đã nghiên cӭu và hình thành nên các kỹ thuật chuyển gen rҩt hiệu quҧ trong đó có hai kỹ thuật đѭợc sử dụng khá phổ biến là: kỹ thuật chuyển gen nhӡ vi khuẩn đҩt Agrobacterium tumerfaciens và kỹ thuật chuyển gen nhӡ súng bắn gen. Có thể tóm tắt cơ sӣ khoa học cӫa hai phѭơng pháp chuyển gen nhѭ sau: Trong phѭơng pháp chuyển gen nhӡ Agrobacterium tumerfaciens, ngѭӡi ta lợi dụng cơ chế chuyển gen tự nhiên cӫa vi sinh vật này qua các vết thѭơng cӫa thực vật gây bệnh hình thành u cho thực vật. Quá trình chuyển gen này đѭợc thực hiện nhӡ một dạng ADN tự do thể vòng có trong tế bào vi sinh vật gọi là Ti-plasmid. Trên Ti-plasmid có đầy đӫ các gen tham gia vào sự chuyển một đoạn ADN mang các gen điều khiển hình thành khối u có mặt trên nó trực tiếp vào bộ NST cӫa tế bào thực vật và làm cho thực vật hình thành u. Bằng kỹ thuật gen, con ngѭӡi đã thiết kế lại Ti-plasmid loại bỏ các gen hình thành u thay thế vào đҩy bằng các gen mong muốn. Vi khuẩn mang Ti-plasmid đã cҧi biến này với gen mong muốn có thể hoạt động nhѭ là bộ máy chuyển gen rҩt hữu hiệu vào thực vật. Kỹ thuật chuyển gen nhӡ vi khuẩn trên thѭӡng đѭợc tiến hành thông qua phѭơng pháp kỹ thuật đĩa lá. Sử dụng các đĩa lá cӫa đối tѭợng cần chuyển gen ngâm trong dung dịch vi khuẩn có mang plasmid chӭa gen mong muốn trong một thӡi gian nhҩt định để plasmid có thể chuyển gen thông qua vết thѭơng xâm nhập vào tế bào lá, sau đó làm sạch vi khuẩn khỏi đĩa lá, nuôi cҩy tái sinh mô lá bằng kỹ thuật nuôi cҩy mô, chọn lọc các cây có mang gen và biểu hiện gen ta sẽ thu đѭợc cây chuyển gen. Phѭơng pháp này đѭợc áp dụng thành công chӫ yếu trên đối tѭợng cây trồng hai lá mầm. 61 Phѭơng pháp chuyển gen nhӡ súng bắn gen đѭợc Sandford ӣ trѭӡng đại học Cornell đề xuҩt nĕm 1987. Nguyên lý chung cӫa phѭơng pháp là có thể sử dụng một dụng cụ tạo một áp lực đẩy đѭợc các “viên đạn” nhỏ có kích thѭớc  = 1m đѭợc cҩu tạo bằng các kim loại trơ (vàng, tungsten) đi với tốc độ 430m/s (súng bắn gen). Các “viên đạn” nhỏ này trѭớc khi “bắn” đã đѭợc ngâm trong dung dịch chӭa các plasmid mang gen mong muốn đã đѭợc thiết kế. Với tốc độ này, “viên đạn” có thể xuyên qua lớp tế bào biểu bì để đi vào các tế bào bên trong và nằm lại trong tế bào gây hoạt động biểu hiện cӫa gen. Phѭơng pháp này cũng cho phép chuyển gen thành công trên các đối tѭợng cây một lá mầm. Tình hình sử dụng cây chuyển gen trong thực tiễn trồng trọt còn nhiều tranh cãi. Nhiều ý kiến cho rằng sử dụng cây chuyển gen có thể tạo ra nhiều rӫi ro chѭa lѭӡng trѭớc đѭợc nhѭ: - Các lѭơng thực thực phẩm từ các cây chuyển gen có thể gây các phҧn ӭng dị ӭng hoặc tác dụng phụ vì sҧn phẩm cӫa gen là các protein lạ. - Có thể gây ra tác động đến môi trѭӡng sinh thái do sự xuҩt hiện những sinh vật lạ chѭa hề xuҩt hiện trѭớc đây (cây có khҧ nĕng kháng sâu do mang gen sҧn sinh chҩt độc Bt chuyển vào, cây mang gen kháng thuốc trừ cỏ...). Các sinh vật này qua lan truyền bằng hạt phҩn có thể tạo ra những loài cây mới nhѭ: cỏ mang đặc tính kháng thuốc trừ cỏ hoặc diệt đi những thiên địch quý không cần diệt. - Trong kỹ thuật chuyển gen, khi thiết kế gen thì các gen mong muốn chuyển vào luôn đѭợc đi kèm với các gen chỉ thị để thuận tiện cho công tác chọn lọc. Trong nhiều trѭӡng hợp, các gen chỉ thị là các gen kháng kháng sinh. Khi vào cây, các gen kháng kháng sinh này có thể đѭợc chuyển vào vi sinh vật đҩt tạo ra các vi sinh vật kháng thuốc kháng sinh. Tuy nhiên, cho đến nay cây chuyển gen vẫn không ngừng đѭợc phát triển. Nĕm 1996, diện tích cây chuyển gen trên toàn cầu là 2,8 triệu ha, trong đó Hoa Kỳ chiếm 51%, Trung Quốc chiếm 39%, Canada và Achentina chiếm 4%, Úc và Mêhico chiếm 1%. Đến nĕm 1997, diện tích trồng cây chuyển gen đã tĕng lên 12,8 triệu ha, trong đó đậu tѭơng, ngô, bông, cҧi dầu chiếm 86%. Nĕm 1999, diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu là 39,9 triệu ha, riêng Mỹ trồng 15 triệu ha đậu tѭơng, 10,3 triệu ha ngô và 3,5 triệu ha bông chuyển gen. Nĕm 2000, diện tích cây chuyển gen trên toàn cầu là 44,2 triệu ha và nĕm 2001 là 52,6 triệu ha. Một sӕ mӕc quan trӑng trong sӵ phát triển kỹ thuұt gen thӵc vұt Nĕm Thành tӵu quan trӑng 1980 Lần đầu tiên chuyển ADN cӫa vi khuẩn vào cây nhӡ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 1983 Tạo các marker chọn lọc, thiết kế lại Ti-plasmid 1984 Biến nạp protoplast 1985 Tạo giống kháng thuốc trừ cỏ 1986 Tạo giống kháng virus, đѭa cây chuyển gen ra thử nghiệm đồng ruộng 1987 Chuyển gen kháng côn trùng nhӡ súng bắn gen 1988 Tạo giống cà chua điều khiển đѭợc quá trình chín 62 1989 Sҧn xuҩt kháng thể ӣ thực vật thѭợng đẳng 1990 Chuyển gen bҩt dục đực cho ngô bằng súng bắn gen 1991 Tạo giống có hàm lѭợng gluxit thay đổi 1992 Tạo giống có khҧ nĕng sҧn xuҩt alcaloit tốt hơn Tạo giống có sự thay đổi về axit béo Chuyển nạp gen bằng súng bắn gen cho lúa mì 1994 Ra đӡi giống cà chua Flavor Saver (sҧn phẩm chuyển gen đầu tiên đѭợc thѭơng mại hoá) 1998 Lần đầu thành công việc chuyển đồng thӡi 10 gen vào một cây Toàn cầu có 48 giống cây chuyển gen đѭợc phép thѭơng mại hoá (trong đó Mỹ có 35 giống) 1999 Chuyển gen cho lúa có giá trị dinh dѭỡng cao hơn Diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu lớn hơn 40 triệu ha DiӋn tích trӗng cây chuyển gen trên toàn cҫu trong nĕm 2002 và 2003 tҥi các nѭớc đang phát triển và các nѭớc công nghiӋp (triӋu ha) Các nѭớc Nĕm 2002 Nĕm 2003 Diện tích tĕng 2003 so với 2002 ha tỉ lệ (%) ha tỉ lệ (%) ha tỉ lệ (%) Các nѭớc công nghiệp 42,7 73 47,3 70 4,6 +11 Các nѭớc đang phát triển 16,0 27 20,4 30 4,4 + 28 Tổng số 58,7 100 67,7 100 9,0 + 15 4.5. Một số thành tựu trong tạo giống bằng phương pháp chuyển gen 4.5.1. Chuyển gen tạo giống cây trồng kháng sâu Dựa vào khҧ nĕng sҧn sinh ra protein độc tố cӫa vi khuẩn Bacillus thuringiensis, nĕm 1987, các nhà nghiên cӭu ӣ Bỉ đã tách đѭợc gen mã hóa cho protein này (Deta toxin). Sau đó gen này đã đѭợc chuyển vào hàng loạt cây trồng (cà chua, khoai tây, hѭớng dѭơng, ...). Ngày nay, ngѭӡi ta đã cҧi tiến promoter để nâng cao sự thể hiện cӫa ARNm mã hóa toxin Bt đồng thӡi thay đổi chuỗi mã hóa Bt để nâng cao tác dụng diệt sâu cӫa cây đã đѭợc chuyển gen. Kết quҧ là sâu ĕn lá cây đã chuyển gen có thể bị chết sau vài phút. Cho đến nay, ngѭӡi ta đã tìm đѭợc nhiều gen Bt khác nhau kí hiệu là Cry có khҧ nĕng tiêu diệt đặc hiệu các côn trùng khác nhau (CryI diệt côn trùng Lepidoptera, CryII diệt côn trùng bộ Lepidoptera và Diptera...). Các gen này đã đѭợc chuyển vào nhiều loại cây trồng khác nhau đặc biệt là bông, ngô, đậu tѭơng, lúa... và tạo nên các giống cây trồng kháng sâu rҩt có ý nghĩa. Các nhà nghiên cӭu còn tiếp tục cҧi tiến các gen Bt để nâng cao hoạt tính độc cӫa gen chuyển vào bằng cách tinh giҧn đoạn gen chuyển vào (chỉ mã hoá cho protein độc) và thay thế các codon cho phù hợp với quá trình phiên mã và dịch mã ӣ thực vật. Kết quҧ là làm tĕng hoạt tính độc lên hàng trĕm lần. 63 Ngoài khuynh hѭớng tạo tính kháng sâu cӫa cây bằng gen Bt, còn có hѭớng chuyển các gen mã hoá cho các protein ӭc chế hoạt động cӫa enzim protease làm hỏng quá trình tiêu hoá cӫa côn trùng. 4.5.2. Chuyển gen tạo giống cây trồng kháng thuốc trừ cỏ Nền nông nghiệp hiện đại, công nghiệp hoá gắn liền với việc sử dụng thuốc trừ cỏ. Vҩn đề đặt ra là khi phun thuốc trừ cỏ sẽ chỉ diệt cỏ mà không diệt cây trồng. Muốn vậy, ngѭӡi ta phҧi tạo ra các giống có đặc tính kháng thuốc trừ cỏ. Để làm việc này, hiệu quҧ nhҩt là sử dụng kỹ thuật chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào cây. Nguyên tắc chung là phҧi tìm đѭợc gen kháng lại cơ chế gây hại cӫa thuốc từ cỏ. Các hѭớng tạo cây trồng kháng thuốc trừ cỏ bao gồm: Nâng cao hoạt tính cӫa các enzim bị hại do thuốc trừ cỏ. Theo hѭớng này, các cây chuyển gen có khҧ nĕng sinh trѭӣng đѭợc ӣ mӭc thuốc trừ cỏ cao hơn mӭc đã gây chết ӣ cây chѭa chuyển gen. Chính vì vậy, khi phun thuốc trừ cỏ ӣ nồng độ tiêu diệt đѭợc cỏ, cây sẽ không bị chết. Tạo ra các enzim đột biến không bị ҧnh hѭӣng cӫa thuốc trừ cỏ. Theo hѭớng này, cây trồng đѭợc chuyển gen có thể là những gen làm cho cây ít mẫn cҧm hơn với sự ӭc chế cӫa thuốc trừ cỏ. Tạo các enzim làm mҩt tính độc cӫa thuốc trừ cỏ. Có nghĩa là các cây chuyển gen có khҧ nĕng biến chҩt trừ cỏ thành dạng không độc cho cây hoặc phân giҧi thuốc trừ cỏ. Có thể nêu một vài ví dụ cụ thể: thuốc trừ cỏ glyphosat là một loại thuốc trừ cỏ phổ biến trên thị trѭӡng có tác dụng diệt cỏ cao, dễ phân giҧi và ít gây ô nhiễm môi trѭӡng. Cơ chế hại cӫa thuốc là kìm hãm hoạt động cӫa một enzim biến đổi sҧn phẩm quang hợp thành axit mang mạch vòng sikimic tên là enzim enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS). Khi axit này không đѭợc hình thành sẽ gây rối loạn toàn bộ quá trình trao đổi chҩt và làm thực vật chết. Ngѭӡi ta đã tìm đѭợc các gen mã hoá EPSPS từ vi sinh vật hoặc từ một số thực vật có hoạt tính rҩt cao đồng thӡi tiếp tục cҧi biến chúng đѭợc chuyển nạp cho cây trồng. Kết quҧ tạo ra cây có hàm lѭợng hoạt tính cӫa enzim EPSPS cao hơn gҩp 4 lần so với cây bình thѭӡng và hoàn toàn chống chịu đѭợc với thuốc trừ cỏ glyphosat. Bằng cách này, ngѭӡi ta đã tạo ra hàng loạt các cây trồng kháng thuốc trừ cỏ mà điển hình là cây đậu tѭơng, ngô, bông, ... 4.5.3. Chuyển gen tạo giống cây trồng kháng virus Bệnh virus gây hại cây trồng rҩt nghiêm trọng và là loại bệnh không chữa đѭợc. Do vậy, việc tạo cây kháng virus là rҩt quan trọng. Dựa vào khҧ nĕng khi bị nhiễm một loại virus yếu hoặc không có hoạt tính độc cho cây thì sau đó cây tỏ ra chống chịu hơn với loại virus gây hại mạnh hơn. Thực nghiệm đầu tiên theo hѭớng này đѭợc tiến hành trên cây thuốc lá và đã thành công tốt đẹp. Có nhiều hѭớng tạo cây kháng bệnh virus bằng kỹ thuật chuyển gen: chuyển gen mã hoá protein vỏ, chuyển gen tạo các ribozyme (enzim phân giҧi virus), chuyển các gen đối bҧn với ARN cӫa virus. Các đối bҧn này sẽ khoá lại sự sao chép và phiên mã cӫa ARN virrus. Trong đó, việc chuyển gen mã hoá protein vỏ virus tѭơng đối phổ biến. Virus có cҩu tạo gồm phần lõi là các axit nucleic (ADN, ARN) và phần vỏ là protein. Khi có mặt gen mã hoá protein vỏ sẵn trong tế bào sẽ gây hiệu ӭng kìm hãm sự nhân virus nhiễm vào. Bằng cách này, ngѭӡi ta đã chuyển các gen mã hoá protein vỏ nhiều loại virus vào các đối tѭợng cây trồng khác nhau và tạo nên các giống kháng virus nhѭ: đu đӫ kháng bệnh virus đóm vòng PRSV (Yeh và cộng sự, 1988; Viện công nghệ sinh học, 2003), các cây chống chịu virus khҧm alfalfa (AMV), virus 64 khҧm dѭa chuột (CMV), cây khoai tây kháng virus X (Lawon và cộng sự, 1990; Stark và Beachy, 1990)... 4.5.4. Chuyển gen tạo giống hoa có kiểu hình và màu sắc mới Việc chuyển gen tạo ra giống hoa mới là một hѭớng đi đầy triển vọng vì cây hoa không phҧi là cây thực phẩm, việc sử dụng sҧn phẩm chuyển gen khá thuận lợi. Cho đến nay, các nghiên cӭu cơ bҧn đã xác định đѭợc hệ thống enzim biến đổi các sắc tố cӫa hoa. Trên cơ sӣ đó có thể chuyển các gen mã hoá các enzim gây ӭc chế hoặc hoạt hoá các khâu cӫa hệ thống biến đổi sắc tố mà tạo nên các giống hoa có màu sắc mới. Ngѭӡi ta cũng có thể chiết tách các gen tổng hợp sắc tố từ các sinh vật để chuyển vào hoa gây tạo giống mới. Ӣ Việt Nam, Chính phӫ chỉ cho phép nghiên cӭu và sử dụng các cây trồng chuyển gen trên các đối tѭợng không phҧi là cây sử dụng trong thực phẩm (đѭợc phép nghiên cӭu trên cây lâm nghiệp, hoa cây cҧnh, ...). Thành công đầu tiên trong lĩnh vực này là việc chuyển gen tạo anthocynin cӫa hạt ngô vào cây hoa Petunia. Gần đây, Coen, 1991 đã phát hiện có 3 gen điều hòa sự phát triển cӫa hoa (điều khiển hình thái, cơ quan cӫa hoa) trên cơ sӣ đó có thể chuyển các gen để tạo hoa có hình thái mới nhѭ: chỉ có cánh hoa mà không có nhị và nhuỵ hoặc có cҩu trúc không gian mới. Ngѭӡi ta cũng chuyển các gen kháng etylen một phytohoocmon gây già nhѭ gen đối bҧn cӫa ACC synthase vào cây hoa để kéo dài tuổi thọ cӫa hoa. 4.5.5. Chuyển gen tạo cây trồng có khả nĕng sản xuất các protein động vật Việc sҧn xuҩt protein nhӡ nuôi cҩy tế bào động vật rҩt tốn kém. Chính vì vậy, các nhà khoa học đã tìm cách tách và giҧi mã đѭợc gen quy định chuỗi protein đó và chuyển gen đó vào thực vật. Một khҧ nĕng sử dụng khác là việc sҧn xuҩt các kháng thể đơn dòng nhӡ thực vật. Ví dụ các kháng thể chống lại độc tố hoặc thuốc trừ cỏ có thể đѭợc sҧn xuҩt trong cây nhằm chống lại tác dụng cӫa các chҩt này. Một hѭớng đang đѭợc tập trung nghiên cӭu là sҧn xuҩt “thực phẩm chӭc nĕng”. Nghĩa là chúng ta có thể chuyển một hay nhiều gen sinh tổng hợp các protein có tác dụng nhѭ là một vaccine phòng bệnh, chúng ta có thể ĕn một quҧ chuối, đu đӫ đã đѭợc chuyển gen tổng hợp protein vaccine đó là đѭợc. Một trong những thuận lợi cӫa các loại vaccine qua miệng là chúng kích thích sự sҧn xuҩt kháng thể mà không cần qua tiêm chӫng và bҧo quҧn dễ dàng. 4.5.6. Chuyển gen tạo giống cây trồng có chất lượng mới Ngѭӡi ta đã nghiên cӭu việc chuyển nạp các gen mã hoá cho các protein chӭa nhiều axit amin methionin vào cây đậu tѭơng và ngô làm thӭc ĕn gia súc do protein cӫa hai cây này bị thiếu axit amin này. Kết quҧ là các cây chuyển gen đã có hàm lѭợng protein giàu methionin cao hơn 8% trong tổng số protein hạt. Chúng ta cũng đã tách đѭợc gen mã hoá cho một loại Thaumatin (một chҩt có độ ngọt gҩp 10.000 lần so với đѭӡng mía) và chuyển nạp gen này vào cây khoai tây. Kết quҧ là toàn bộ thân, lá, rễ cũng nhѭ cӫ cӫa cây đѭợc chuyển gen đều ngọt. Trong ngành chĕn nuôi thѭӡng sử dụng đậu tѭơng và ngô làm thӭc ĕn gia súc. Tuy nhiên, các thӭc ĕn này thѭӡng thiếu các axit amin chӭa lѭu huỳnh. Để giҧi quyết vҩn đề này, ngѭӡi ta 65 đang nghiên cӭu việc chuyển nạp các gen mã hoá cho các protein chӭa nhiều axit amin methionin vào cây. Các protein giàu methionin thѭӡng có mặt trong các loại cây lạc Brazil, hѭớng dѭơng, lúa mì và lúa gạo. Một trong các gen cӫa những cây trên đã đѭợc chuyển nạp thành công vào thuốc lá. Cây chuyển gen đã có hàm lѭợng protein giàu methionin cao hơn 8% trong tổng số protein cӫa hạt. Cây thuốc lá đã đѭợc sử dụng cho việc tổng hợp lactoferrin cӫa ngѭӡi. Tuy nhiên, protein này cần thiết phҧi tinh chế trѭớc khi chúng có thể đѭợc sử dụng cho bҩt kể một dạng thực phẩm nào. Gen tổng hợp lactoferrin cӫa ngѭӡi cũng đã từng đѭợc chuyển vào cây khoai tây và đã thu đѭợc cây khoai tây có khҧ nĕng tổng hợp lactoferrin. Tuy nhiên, nồng độ lactoferrin đѭợc tổng hợp rҩt thҩp trong cây khoai tây. Hệ thống này rҩt tốt bӣi vì khoai tây là một phần trong bữa ĕn cӫa rҩt nhiều ngѭӡi. Tuy nhiên, nó cũng có thể gặp khó khĕn khi protein này có thể có các hoạt tính sinh học khác dѭới tác dụng cӫa nhiệt độ khi đun nҩu khoai tây. Gần đây nhҩt, con ngѭӡi đã chuyển gen tổng hợp protein có trong sữa ngѭӡi vào thực vật. Cây lúa đã từng đѭợc chuyển gen tổng hợp ferritin đậu tѭơng để làm tĕng thành phần sắt có trong hạt gạo và ngày nay nó lại đѭợc sử dụng để sҧn xuҩt protein sữa ngѭӡi nhѭ là lactoferrin, lisozyme và α1-antitrypsin. Đặc biệt là gen này có khҧ nĕng biểu hiện rҩt tốt và tổng hợp đѭợc các chҩt trên với nồng độ rҩt cao; ví dụ có thể đạt đѭợc 5g lactoferrin trong 1kg dehusked lúa trong một vài thế hệ (generations). 4.5.7. Chuyển gen tạo tính bất dục ở cây trồng Cây bҩt dục có ý nghĩa rҩt quan trọng trong công tác tạo giống lai. Tuy nhiên, để tạo bҩt dục đực phҧi tốn nhiều thӡi gian, sӭc lực và công việc phӭc tạp. Nhiều nhà chọn giống đề nghị một phѭơng pháp mới để làm mҩt chӭc nĕng cӫa hạt phҩn. Phѭơng pháp này tỏ ra hiệu quҧ và có khҧ nĕng ӭng dụng lớn. Phѭơng pháp này có liên quan đến promoter (TA29) cӫa các gen đặc hiệu cӫa hạt phҩn hoa cây thuốc lá. Promoter này chỉ hoạt động trong tapetrin và chỉ ӣ những giai đoạn phát triển hoa nhҩt định. Tapetrin là một lớp tế bào đơn bọc vòng quanh buồng hạt phҩn phía trong bao phҩn và đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển cӫa hạt phҩn. Khi một gen ARNase đѭợc cặp đôi với promoter TA29 rồi đѭa vào thuốc lá hoặc cây cҧi dầu sẽ tạo ra cây vẫn hoạt động bình thѭӡng nhѭng hạt phҩn không còn chӭc nĕng thụ phҩn, thụ tinh. Câu hỏi ôn tập chương 3 1. Khái niệm về tính trạng, tính trạng số lѭợng và tính trạng chҩt lѭợng? Đặc điểm cӫa tính trạng số lѭợng và tính trạng chҩt lѭợng? 2. Khái niệm hệ số di truyền và ý nghĩa cӫa hệ số di truyền trong chọn lọc? 3. Chọn lọc hỗn hợp và chọn lọc cá thể? Điểm khác nhau cơ bҧn giữa chọn lọc hỗn hợp và chọn lọc cá thể? 4. Phѭơng pháp chọn lọc ӣ cây tự thụ phҩn, giao phҩn, sinh sҧn vô tính? 5. Các nguyên tắc chung để chọn dạng bố mẹ? 6. Các phѭơng thӭc lai cơ bҧn? 7. Kỹ thuật lai giống cây trồng? 66 8. Phѭơng pháp tạo giống lai ӣ cây tự thụ phҩn, cây giao phҩn? 9. Phѭơng pháp tạo giống lai sử dụng ѭu thế lai? 10. Phѭơng pháp tạo giống đột biến và đa bội thể? 11. Vai trò và triển vọng cӫa CNSH trong công tác giống cây trồng? 12. Công nghệ nuôi cҩy mô tế bào thực vật? 13. Các ӭng dụng chính cӫa công nghệ nuôi cҩy mô tế bào thực vật trong công tác giống cây trồng? 14. Công nghệ gen trong chọn giống cây trồng? 15. Một số thành tựu trong chọn giống bằng phѭơng pháp chuyển gen? 67 Chương 4. KHҦO NGHIӊM GIӔNG CÂY TRӖNG 1. Khҧo n