Bài giảng Dinh dưỡng – tăng trưởng của vi khuẩn

DINH DƯỠNG – TĂNG TRƯỞNGCỦA VI KHUẨN NỘI DUNG Nhu cầu dinh dưỡng và yếu tố tăng trưởng Cách tăng trưởng, biểu đồ tăng trưởng & các phương pháp đo sự tăng trưởng Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tăng dân số; phân biệt các nhóm vsv theo nhiệt độ, pH và oxy Kiểm soát sự tăng trưởng của vi khuẩn Các ứng dụng trong nghiên cứu, chẩn đoán, CNVS 1. DINH DƯỠNG VI KHUẨN TẠO NĂNG LƯỢNG, VẬT LIỆU XÂY DỰNG TẾ BÀO Môi trường có: . Các chất dinh dưỡng thích hợp &ø cần thiết để tạo nguyên sinh chất (C, N, chất khoáng, các nguyên tố khác) . Thông khí thích hợp: bình thường,  CO2 hoặc đuổi hết khí O2 . pH thích ứng . Độ ẩm đủ . Nhiệt độ thích hợp 1.1. Nhu cầu dinh dưỡng 1.1.1. Nhu cầu năng lượng Ba nguồn năng lượng: ánh sáng, chất vô cơ & chất hữu cơ Cơ chế : lên men (chất nhận H+ là chất hữu cơ) hô hấp hiếu khí (chất nhận H+ là oxy ),  yếm khí (chất nhận H+ là chất vô cơ khác oxy ) quang hợp trong vi khuẩn quang tổng hợp chất hữu cơ : acid amin, hydrat carbon chất vô cơ : CO2, SO4--, NO3-, H2S  ATP 1.1.2. Chất dinh dưỡng Chất dinh dưỡng thiết yếu: bắt buộc phải có cho sự tăng trưởng VK Chất dinh dưỡng có ích: nếu có thì được VK sử dụng nhưng không bắt buộc phải có Chất dinh dưỡng lượng lớn: C, N, P, S, K, Mg, Ca, Na, Fe Chất dinh dưỡng vi lượng: Co, Zn, Mo, Cu, Mn, Ni, W, Se Chất dinh dưỡng lượng lớn Carbon * 50% chất khô tế bào * Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của các nguồn C tùy thuộc 1. Thành phần và cấu tạo hóa học nguồn C, mức độ oxy hóa của các nguyên tử carbon 2. Đặc điểm sinh lý của vi sinh vật - Các hợp chất có phân tử thấp (đường): đồng hóa trực tiếp - Các hợp chất hữu cơ cao phân tử (tinh bột, protein …)  cần enzym thủy phân - Những hợp chất không tan trong nước (cellulose, lipit, parafin) hấp phụ quanh bề mặt và phân giải dần dần * Nguồn carbon - Quang tổng hợp: CO2 - Khác: hydrat carbon (glucose, lactose, tinh bột), acid amin,  acid béo, acid hữu cơ, các base nitơ, hợp chất thơm và vô số các hợp chất hữu cơ khác Phân loại VSV theo dinh dưỡng .Ba loại nguồn năng lượng Aùnh sáng Quang dưỡng (Phototroph) Chất vô cơ Vô cơ dưỡng (Lithotroph) Chất hữu cơ Dị dưỡng (Heterotroph) .Hai loại nguồn carbon Vô cơ (CO2) Tự dưỡng (Autotroph) Hữu cơ Dị dưỡng (Heterotroph) Một số tập hợp từ Năng Lượng Carbon Quang tự dưỡng - Photoautotroph ánh sáng chất vô cơ Quang dị dưỡng - Photoheterotroph ánh sáng chất hữu cơ Hóa vô cơ tự dưỡng - Chemolithoautotroph vô cơ CO2 Hóa vô cơ dị dưỡng - Lithotrophic heterotroph vô cơ chất hữu cơ Dị dưỡng - tự dưỡng C - Heterotroph C-autotroph hữu cơ CO2 Dị dưỡng - Heterotroph chất hữu cơ Nitơ * Là thành phần chính của protein, acid nucleic cũng có trong polysaccharide, peptidoglycanChiếm 12 - 15% chất khô của tế bào * Giá trị dinh dưỡng tùy thuộc:1. Đặc điểm sinh lý của vi sinh vật 2. Tỉ lệ C : N trong môi trường ảnh hưởng khả năng trao đổi chất, tích tụ sản phẩm sinh tổng hợp và tạo thành các hệ enzym tiến hành các phản ứng hóa sinh * Nguồn N - Vô cơ: amoni (NH3), nitrat (NO3- ), nitrit (NO2- ) N2: Cyanobacteria, Rhizobium, Azotobacter - Hữu cơ: pepton, nước thịt, cao ngô, bột đậu tương v. v... Phospho * Thành phần DNA và RNA, ATP, phospholipid … * Nguồn P - Vô cơ: muối phosphate, thường dùng KH2PO4 - Hữu cơ: acid nucleic, phospholipid. VSV có các enzym phosphatase thủy phân ester phosphat hữu cơ, giải phóng phosphat vô cơ tự do Lưu huỳnh * Có trong acid amin (cystein và methionin), một số vitamin (thiamin, biotin, acid lipoic) * Nguồn S - Hữu cơ - Vô cơ: muối sunfat (SO42-) hoặc sunfit (HS-) Thường dùng MgSO4. 7H2O Kali: cần để hoạt hóa nhiều enzym / sinh tổng hợp protein Thường dùng K2HPO4 Magie: làm ổn định các ribosom, có trong màng tế bào, acid nucleic và cũng cần cho hoạt động của nhiều enzym, đặc biệt là enzym/ vận chuyển phosphat. Thường dùng MgSO4. 7H2O Canxi: không phải là thiết yếu, có trong thành tế bào nội bào tử Natri: cần cho một số vi sinh vật Sắt: có trong nhiều enzym của tế bào - enzym hô hấp Chất dinh dưỡng vi lượng (nguyên tố vết) Coban cần cho sự tạo vitamin B12 Kẽm có trong nhiều enzym (cacbonic anhydrase, ancol dehydrogenase, ADN và ARN polymerase) Cần cho nối các tiểu đơn vị protein trong sắp xếp các hình thể đặc biệt cho hoạt động enzym Molypden có trong một số enzym molybdoflavoprotein liên quan tới việc khử nitrat hấp thu, nitrogenase liên quan khử N2 Đồng có trong một số enzym liên quan đến hô hấp Mangan làm hoạt hóa nhiều enzym, có trong một số superoxyt dismutase Niken có trong các enzym hydrogenase có chức năng nhận hoặc phóng thích H2 Tungsteng và selen được cần bởi các vi khuẩn có khả năng định dạng chuyển hóa. Selen là thành phần của enzym dehydroganase 1.2. Yếu tố tăng trưởng (Growth Factors) => đột biến gene --> thiếu enzyme vi khuẩn khác nhau cần những yếu tố tăng trưởng khác nhau X X Là hợp chất hữu cơ, lượng rất nhỏ, cần thiết cho sự tăng trưởng của vi khuẩn nhưng tế bào vi khuẩn không có khả năng tổng hợp được Cơ chế Các vitamin: B1 Biotin B6 B12 tham gia quá trình tạo năng lượng, xây dựng các đại phân tử là coenzym Các acid amin; 20 loại thành phần của protein Purin và pyrimidin Yếu tố tăng trưởng * Nguồn: - Các nguyên liệu hữu cơ phức tạp như cao men, pepton - Môi trường tổng hợp: các vitamin, aa,  purin và pyrimidin dạng base tự do hoặc nucleoside Môi trường tổng hợp chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết ở dạng hóa học tinh khiết, do đó có thành phần hóa học xác định được dùng trong một số nghiên cứu vi sinh vật khó làm và đắt tiền Môi trường tự nhiên (môi trường hỗn hợp) chứa các thành phần cần thiết nhưng không xác định thành phần hóa học các sản phẩm hữu cơ từ thực vật, động vật, nấm men, các muối Thường dùng cao mạch nha, mô động vật sống, cao men,  cao thịt, casein, protein đậu nành… 1.3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường cơ bản: đủ các chất dinh dưỡng cần thiết  thích hợp cho đa số vi khuẩn tăng trưởng  pepton và cao thịt / nước thịt, 0.5% NaCl Dạng lỏng (canh thang) Dạng đặc thêm 1 - 2% thạch, silicagel Môi trường chuyên chở: rất ít chất dinh dưỡng, đủ để vi khuẩn sống nhưng không phát triển chỉ có muối đệm, để chuyên chở mẫu và bệnh phẩm Phổ biến: Cary-blair Môi trường phong phú: + máu, huyết thanh, dịch nấm men, aa  hoặc các hỗn hợp chất dinh dưỡng khác để sơ bộ phân lập và nuôi cấy các vi khuẩn “kén ăn” Thạch máu / Streptococci gây bệnh đau họng và sốt phát ban Thạch chocolat để kích thích tăng trưởng của Neisseria Môi trường chọn lọc: + chất ngăn chặn sự tăng trưởng của hầu hết các loại vi khuẩn trừ loại ta muốn khảo sát chọn lọc ít: Eosin Methylene Blue agar (EMB)  đường / E. coli và các vi khuẩn Gram âm khác  eosin và xanh methylen ức chế các vi khuẩn Gram (+) ==> khóm E. coli có màu tím óng ánh kim loại chọn lọc vừa: Salmonella và Shigella (SS)  muối mật, brilliant green > Tăng trưởng ở vi khuẩn là sự gia tăng số lượng Sự sinh sản của vi khuẩn là hậu quả của sự tăng trưởng Sinh sản phân đôi Sao chép ADN Kéo dài tế bào Tạo vách riêng xong Tách riêng tế bào Tạo vách ADN 2.1. Một số định nghĩa Sự tăng trưởng: gia tăng về số lượng tế bào vi sinh vật Tốc độ tăng trưởng: sự thay đổi về số tế bào /1 đơn vị thời gian Thế hệ: khoảng để 1 tế bào  2 tế bào Thời gian thế hệ = thời gian nhân đôi: 1 - 3 giờ, 10 phút, 7 ngày Tăng trưởng lũy thừa: ở mỗi giai đoạn, số tế bào tăng gấp đôi số đơn vị tham gia  Tăng trưởng lũy thừa Ban đầu tốc độ gia tăng số tế bào chậm nhưng sau đó tăng lên nhanh do số tế bào tăng theo lũy thừa Ví dụ: 0-30’ 1 tế bào / 30 phút 4 -4,5 giờ 256 tế bào / 30 phút Đồ thị số tế bào theo logarit, thời gian theo số học (bán logarit) Thời gian (giờ) Tổng số tế bào 0 1 0.5 2 1 4 1.5 8 2 16 2.5 32 3 64 3.5 128 4 256 4.5 512 5 1.024 5.5 2.048 : : 10 1.048.576 Số tế bào (số học) Số tế bào (logarit) Logarit Số học Thời gian (giờ) Dân số vi khuẩn sẽ gia tăng theo số thế hệ SỐ THẾ HỆ Số vi khuẩn sau mỗi thế hệ khi bắt đầu với 1 vi khuẩn 5 vi khuẩn No vi khuẩn 0 1 5 No 1 2 = 21 10 = 5 x 21 2 No = No x 21 2 4 = 22 20 = 5 x 22 4 No = No x 22 3 8 = 23 40 = 5 x 23 8 No = No x 23 4 16 = 24 80 = 5 x 24 16 No = No x 24 ….. n = 2n = 5 x 2n N = No x 2n N = No x 2n No : số vk lúc đầu; N : số vk sau n thế hệ; n : số thế hệ g = t/n g : thời gian cho mỗi thế hệ, t : thời gian cho n thế hệ k : hệ số tốc độ tăng trưởng (giờ-1) = số thế hệ trong 1 đơn vị thời gian TTLT Cách tính thời gian thế hệ Đo N và N0 => n => g Tính n: Log N = log N0 + n log 2 Log N – log N0 = n log 2 Tính g : t log2 t g = = logN - logNo 3,3 (log N – log N0) => đo hai lần số vi khuẩn trong thời kỳ tăng trưởng lũy thừa -->  thời gian trung bình của một thế hệ Ví dụ: N0 = 5 X 107 , t = 2 , N = 108 n = 3,3 [log 108 - log (5x107)] = 3,3 (8 - 7,69) = 3,3 (0,301) = 1 g = t/n = 2/1 = 2 giờ Biết n và t => tính g và k cho các vi sinh vật khác nhau nuôi ở các điều kiện khác nhau Giúp tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy vsv  kiểm tra ảnh hưởng của biện pháp xử lý vi sinh vật Ln 2 g k = 0,693 2 = = 0,35 thế hệ/giờ A B C D Tốc độ tăng trưởng C. perfringens g = 10’ E. coli g = 20’ Pseudomonas g = 60’ M. tuberculosis g = 3 giờ Số thế hệ Thời gian (phút) 20 40 60 2.2. Tăng trưởng trên môi trường lỏng cấy vào môi trường một lượng vi khuẩn nhất định, ấp ở điều kiện nuôi dưỡng tối ưu, sau đó từng thời gian xác định mức độ tăng trưởng Đường tăng trưởng gồm 4 thời kỳ chính : Thời kỳ tiềm ẩn (The Lag Phase) Thời kỳ lũy thừa (The exponential phase) Thời kỳ ổn định cực đại (The maximum stationary phase) Thời kỳ suy thoái (The phase of decline) Thời kỳ tiềm ẩn - Thích ứng dần với môi trường mới, tích lũy những chất cần thiết cho tế bào mới - Đây là thời kỳ hoạt động mạnh nhất mặc dù dân số vi khuẩn không gia tăng Thời gian tùy thuộc trạng thái vi khuẩn và điều kiện môi trường Thời kỳ lũy thừa - Tế bào bắt đầu phân chia với tốc độ không thay đổi: Dân số tăng gấp đôi sau mỗi thế hệ => số vi khuẩn mới tăng theo lũy thừa - Tế bào tăng trưởng cân bằng: tất cả các thành phần gia tăng cùng tốc độ nồng độ vi khuẩn khoảng 109/ml Kéo dài 4 - 10 giờ Pha Lũy thừa và Ý nghĩa thực tế 1. Cấy vi khuẩn giai đoạn logarit vào môi trường mới cùng thành phần thì vi khuẩn sẽ tăng trưởng logarit ngay, tránh được giai đoạn tiềm ẩn 2. Sử dụng Chemostat, Bretogen ... để nuôi liên tục nhằm duy trì dân số ở pha tăng trưởng lũy thừa kiểm soát cả mật độ tế bào & tốc độ tăng trưởng thay đổi độ pha loãng đổi nồng độ dinh dưỡng trong môi trường dự trữ Thời kỳ ổn định cực đại Chất dinh dưỡng bắt đầu cạn, chất độc tích tụ với nồng độ khá cao, pH thay đổi v. v ... làm cho tỷ suất tăng trưởng giảm. Trong thời kỳ này dân số vi khuẩn cực đại và không thay đổi, số vi khuẩn chết  với số vi khuẩn mới sinh thời gian tùy thuộc vào loại vi khuẩn và điều kiện môi trường Thời kỳ suy thoái Tỷ suất chết tăng dần đến một mức độ cố định. Thông thường sau khi đa số tế bào đã chết, tỷ suất chết giảm rõ rệt vì số nhỏ tế bào sống sót sẽ tồn tại trong vài tháng hoặc vài năm với chất dinh dưỡng do tế bào chết thoái hóa thải ra. 2.3. Đo sự tăng trưởng = đo sự tăng số lượng hoặc tăng sinh khối * Xác định toàn phần vi khuẩn - Đếm tổng số tế bào: Nhuộm vi khuẩn và đếm bằng phòng đếm dưới kính hiển vi - Đo trọng lượng tế bào: rửa sạch khối vi khuẩn, làm khô rồi cân (khó chính xác) - Đo độ đục của môi trường nuôi cấy vi khuẩn - Đo nồng độ của một chất cần thiết trong thành phần cấu tạo tế bào . Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjehldal Quá trình đếm trực tiếp kính hiển vi với buồng đếm Petroff-Hausser Gờ đỡ kính đậy Thêm mẫu vào  Có 25 ô vuông lớn, Stc là 1 mm2 Vtc là 0,02 mm3 Quan sát kính hiển vi; tất cả tế bào trong ô vuông lớn được đếm: 12 tế bào (đếm vài ô và lấy số trung bình) Tính số lượng trên ml mẫu  12 tb x 25 ô x 50 x 103 = 1,5 x 107 Số lượng/ mm2 Số lượng/ mm3 Số lượng/ cm3 (ml) Lọc / lăng kính Io I Mẫu chứa tế bào Quang bào đo I . Qphổ kế D = Log Io/ I . Quang kế Klett = OD/0,002 VSV A Đơn vị Klett VSV B Đơn vị Klett Thực tế Lý thuyết Thời gian (giờ) Số tế bào or trọng lượng khô Đo độ đục * Xác định vi khuẩn sống - Đếm số khóm trên bản thạch - Xác định bằng CO2 giải phóng hay oxy hấp thu - Xác định sản phẩm của vi khuẩn Phương pháp trải đĩa Phương pháp đổ đĩa Ủ Nhỏ mẫu lên bề mặt đĩa thạch (0,1 ml) Dùng que gạt tiệt trùng trải mẫu khắp mặt thạch Kết quả trải đĩa điển hình Các khóm trên mặt Các khóm chìm dưới Nhỏ mẫu vào đĩa tiệt trùng Thêm môi trường tiệt trùng vào và trộn kỹ Kết quả đổ đĩa điển hình Các khóm trên mặt Hai phương pháp tiến hành đếm sống (đếm đĩa) ==> đơn vị tạo khóm (CFU) = số tế bào sống - Khó thực hiện - Cho thông tin tốt nhất về số tế bào sống --> được áp dụng rộng rãi Pha loãng 2.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng Nhiệt độ pH Aùp suất thẩm thấu Oxy Tốc độ tăng trưởng Tối thiểu Tối đa Tối ưu Aûnh hưởng của nhiệt độ lên tốc độ tăng trưởng và hiệu ứng phân tử của tế bào Tốc độ tăng trưởng Ưa lạnh Trung bình Ưa nhiệt Ưa nhiệt cao Ưa nhiệt cao Nhiệt độ (0C) Nhiệt độ tối ưu Mối liên hệ giữa nhiệt độ với tốc độ tăng trưởng của VSV Tối thiểu Tối ưu Tối đa Ưa lạnh  00C  150C  200C Ưa nhiệt ≥ 450C Ưa nhiệt cao ≥ 800C pH tăng trưởng và pH tối ưu vi sinh vật ưa acid: Nấm tăng trưởng tối ưu ở pH  5 Một số VSV tăng trưởng tốt ở pH 2 Vi khuẩn ưa acid bắt buộc: H. pylori Các vi sinh vật ưa kiềm có pH tăng trưởng tối ưu rất cao, đôi khi là pH 10-11 Vibrio cholerae, nhiều loại Bacillus Các vi sinh vật ưa trung tính : tăng trưởng tối ưu ở pH 6-8 Thêm các chất đệm vào môi trường nuôi : Đệm photphat Aûnh hưởng của nồng độ hydro (pH) Nhu cầu nước ở dạng nước có sẵn (hàm lượng nước và các chất tan trong nước trong môi trường) hoạt tính nước thấp  vsv tăng nồng độ chất tan nội bào bơm các ion vô cơ vào tế bào hoặc  tổng hợp / cô đặc chất hữu cơ hòa tan Ví dụ: Staphylococcus aureus / 7,5% NaCl --> phân lập Giải thích: do VSV sản xuất chất tan cạnh tranh acid amin proline, acid amin ectoine, glycerol Aûnh hưởng của áp suất thẩm thấu Mối liên hệ của oxy với vi sinh vật Nhóm Mối liên hệ với oxy Ví dụ Hiếu khí Bắt buộc Cần M. tuberculosis C. diphtheriae P. aeruginosa Tùy ý Không cần tốt hơn nếu có O2 E. coli Vi hiếu khí Cần O2 với mức thấp Staphylococcus hơn trong không khí Campylobacter, Actinomyces Kỵ khí Chịu được Không cần và tăng trưởng không khí tốt hơn nếu không có oxy Streptococcus pyogenes Bắt buộc Có hại hoặc chết C. botulinum, C. perfringens Aûnh hưởng của oxy Sản phẩm oxy độc và enzym khử O2 + e-  O2- Superoxid O2- + e- + 2H+  H2O2 Hydro peroxid H2O2 + e- + H+  H2O + OH Gốc hydroxyl OH + e- + H+  H2O Nước Tổng cộng: O2 + 4 e- + 4H+  2 H2O Catalase H2O2 + H2O2  2 H2O + O2 Peroxidase H2O2 + NADH + H+  2 H2O + NAD+ Superoxide dismutase O2- + O2- + 2 H+  H2O2 + O2 Phối hợp Superoxide dismutase/catalase 4 O2- + 4 H+  2 H2O2 + 3 O2 Ứng dụng trong nuôi cấy vi sinh vật Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí : lắc, khuấy, sục khí tiệt trùng Nuôi cấy yếm khí : khử oxy trong môi trường nuôi = đổ môi trường đầy ắp và vặn chặn nút, thêm chất khử oxy thành nước (thioglycolat) Loại hoàn toàn oxy = cho khí tiêu oxy vào trong bình đựng đặc biệt (a) Tăng trưởng hiếu khí (b) Yếm khí (c) Tùy ý (d) Vi hiếu khí (e) Yếm khí chịu được không khí Kiểm tra nhu cầu oxy của vi sinh vật bằng môi trường thioglycolate 3. ỨNG DỤNG 3.1. Kiểm soát vi sinh vật Phương pháp vật lý Phương pháp hóa học 3.2. Định lượng 3.3. Công cụ của sinh học 3.4. Nhận định vi khuẩn 3.1. Các phương pháp vật lý kiểm soát vi sinh vật Nhiệt ẩm với áp suất > 90% sản phẩm y tế và các phòng thí nghiệm nồi hấp (autoclave) ở 121 oC, áp suất 1.1 kg/cm2 Nhiệt ẩm không áp suất Đun sôi Phương pháp Pasteur: 62.8oC/ 30’ hoặc đun nóng đến 71.7 oC/ 15’ không tiệt trùng nhưng diệt vi khuẩn gây bệnh trong dung dịch Nhiệt khô Sấy: 180 oC / 2 giờ diệt được bào tử vi khuẩn Đốt trên ngọn lửa trong thời gian ngắn; Lò thiêu Ánh sáng tử ngoại Ion phóng xạ Lọc: màng lọc ester cellulose; lọc khí HEPA (High-Efficacy Particulate Air) Kiểm soát vi sinh vật bằng phương pháp hóa Các yếu tố ảnh hưởng tác động tẩy trùng Thời gian Nhiệt độ pH Loại vi sinh vật *Nhóm A : dễ bị giết -Vi khuẩn dạng sinh dưỡng  - virus có màng bao *Nhóm B : khó giết hơn - vi khuẩn lao  - virus không có màng bao *Nhóm C : virus và bào tử vi khuẩn đề kháng cao ví dụ virus gây viêm gan Sự hiện diện xung quanh Nồng độ chất tẩy trùng Các nhóm kháng khuẩn hóa học Dung môi hữu cơ : cloroform, toluen, cồn. Kim loại nặng : hợp chất của thủy ngân, bạc, đồng. Phenol và dẫn xuất : phenol, cresol, hexachlorophene, chlorhexidine. Các halogen : iốt, clo, cồn Iod Chất tẩy (detergent) làm sạch nhưng không sát khuẩn. Các tác nhân tác động bề mặt : hợp chất amoni bậc bốn, chất tẩy anion. Formaldehyde : dung dịch 5 - 10% formalin làm cố định mô (Có mùi khó chịu và kích ứng mô nên ít sử dụng). Glutaraldehyd Hydrogen peroxide dung dịch 3% Ethylene oxide Các chất tẩy ttrùng khác : acid, kiềm, muối của chúng. Các tác nhân hóa trị liệu Là các chất hóa học tác động chọn lọc trên sự tăng trưởng của vi sinh vật, tác động không đáng kể trên các chức năng của tế bào động vật chủ bị nhiễm gọi là có độc tính chọn lọc Các tác nhân tổng hợp: Sulfonamide, PAS, INH, Ethambutol Kháng sinh 3.2. Sử dụng vi sinh vật định lượng bằng pp sinh vật Định lượng vitamin, acid amin Nguyên tắc: - Môi trường dinh dưỡng cần thiết thỉ thiếu chatá định lượng - Chủng vi sinh vật cần chatá định lượng cho tăng trưởng B1: Xây dựng đường cong tăng trưởng / lượng chất thêm vào B2 : Thêm những lượng khác nhau của nguyên liệu vào môi trường cơ bản  đo lượng tăng trưởng xảy ra B3: So với đường cong chuẩn  lượng chất trong nguyên liệu Vi khuẩn lactic - định lượng acid lactic sản xuất Ưu: xác định lượng rất nhỏ acid amin - thấp xa lượng có thể định lượng bằng phương pháp hóa Định lượng kháng sinh Nguyên tắc: đo sự ức chế tăng trưởng Vi sinh vật là công cụ của sinh học Nhận định vi khuẩn Nhận định vi khuẩn gây bệnh Thử độ nhạy cảm của kháng sinh  giúp chẩn đoán và điều trị kịp thời