Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp

Công nghệ DNA tái tổ hợpNguyễn Hoàng Lộc Đại học HuếHuế 2007Bài giảng Chương 1Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử ENZYME HẠN CHẾ (RE) Các RE cắt DNA ở các vị trí nhận biết đặc hiệu của chúng gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, có khả năng tạo ra các đoạn DNA có đầu tận cùng đầu bằng hay đầu so le. Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi 6 nucleotide, enzyme HaeIII nhận biết chuỗi 4 nucleotide: EcoRIHaeIIIđầu so leđầu bằng1. Gắn các đầu tận cùng được enzyme hạn chế cắtDNA ligaseDNA ligase2. Isochizomer Là trường hợp những enzyme được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhưng lại cắt trong một trình tự, các enzyme đó được gọi là isochizomer. II. DNA POLYMERASE (DNA-DEPENDENT-DNA POLYMERASE) DNA polymerase I của E. coliChuỗi polypeptide có khối lượng phân tử 109.000 Da. Có 3 hoạt tính:2. Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli Khối lượng phân tử 76.000 Da. Là DNA polymerase I nhưng thiếu hoạt tính exonuclease 5’→ 3’.3. DNA polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected E. coli) Khối lượng phân tử 114.000 Da. Hoạt tính exonuclease của DNA polymerase phage T4 lớn hơn của DNA polymerase I của E. coli đến 200 lần. DNA polymerase phage T4 không cần có primer vẫn tổng hợp được DNA. 4. Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) Khối lượng phân tử 65.000 Da. Taq DNA polymerase là một loại DNA polymerase chịu nhiệt lấy từ vi khuẩn Thermus aquaticus. III. ENZYME PHIÊN MÃ NGƯỢC (REVERSE TRASNCRIPTASE) Enzyme tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA. Có ở trong các retrovirus. Có các hoạt tính: IV. LIGASE 1. Bacteriophage T4 DNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Khối lượng phân tử 68.000 Da. Enzyme xúc tác tạo liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH đầu 5’-PO4 trong DNA sợi đôi.2. RNA ligase T4 (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme xúc tác tạo liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH đầu 5’-PO4 trong RNA hoặc DNA sợi đơn.V. CÁC LOẠI ENZYME KHÁC1. Terminal transferaseEnzyme xúc tác tạo đuôi homopolymer ở đầu 3’ của DNA sợi đôi làm cho lồi ra một đầu ở cuối.2. DNA-dependent RNA polymerase (Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium LT2, bacteriophage T7 hoặc T3-infected E. coli) Enzyme xúc tác tổng hợp RNA trên khuôn mẫu DNA sợi đôi có mang promoter đặc trưng của bacteriophage. 3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA. Hai loại phản ứng thường xảy ra là:4. Alkaline phosphatase (E. coli và ruột bê) Cả hai enzyme alkaline của vi khuẩn (bacteria alkaline phosphatase, BAP) và ruột bê (calff intestinal alkaline phosphatase, CIP) đều xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA và RNA. 5. Nuclease S1 Enzyme cắt DNA sợi đơn hoặc RNA để tạo ra đầu 5’-monophosphate hoặc các oligonucleotide. VI. CÁC PROTEIN LIÊN KẾT DNA SỢI ĐƠN (SINGLE STRANDED DNA-BINDING PROTEINS) Có khả năng phá vỡ sự ổn định của các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi nucleotide. Tăng nhanh sự tái ủ của các polynucleotide bổ sung. Tăng hoạt tính của các enzyme DNA polymerase.Chương 2Điện di gel I. ĐiỆN DI AGAROSE GEL Điện di agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA. Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành phần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%.Cấu trúc phân tử của agarose1. Các thông số ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di Kích thước của phân tử DNA Nồng độ agarose Cấu hình của DNA Thành phần base và nhiệt độ.Điện di DNA ở các nồng độ agarose khác nhau. 1000 bp1000 bp1000 bp 0,7% 1,0% 1,5%2. Phương pháp điện di Đệm pH Đệm Tris-acetate, Tris-borate, Tris-phosphate (50 mM và pH 7,5-7,8). Agarose gel Agarose type II có nội thẩm thấu thấp. Nhuộm DNA trong agarose gel Dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr và quan sát dưới UV. Một số phương pháp thu hồi DNA từ agarose gel Agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp, ly tâm, điện di vào bẫy, hạt thủy tinh. 3. Quy trình điện diĐiện di DNA trên agarose gel chụp dưới ánh sáng tử ngoại. SM: Chuẩn kích thước của DNA (pUC18/HaeIII). Các đường từ 1-8: các mẫu DNA khác nhau.Thiết bị chụp ảnh DNA dưới ánh sáng UV (Gel documentation)II. ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GELĐược dùng để phân tách các đoạn DNA có chiều dài 300 kb.Thể tái tổ hợp BAC được biến nạp vào trong tế bào E. coli bằng xung điện. Một số ưu điểm của hệ thống BAC:Ổn định.Dễ biến nạp.Tốc độ sinh trưởng của vật chủ E. coli nhanh.Dễ tinh sạch.2. Tạo dòng trong BACVI. YAC VECTOR Đặc điểm của YACYAC là các vector tạo dòng mạch thẳng dựa trên cấu trúc nhiễm sắc thể tự nhiên của nấm men. Có thể được cắt thành hai đoạn hoặc hai nhánh nhiễm sắc thể để nhận các đoạn rất lớn có kích thước lên đến 2.000 kb. Một số nhược điểm:Hiệu suất tạo dòng của một vài hệ thống tương đối thấp. Xuất hiện các dòng khảm. Sự không ổn định của đoạn chèn.Thao tác tương đối khó khăn. 2. Tạo dòng trong YACThư viện genomic DNA là một tập hợp các đoạn DNA cùng đại diện cho một genome nguyên vẹn (hoặc gần nguyên vẹn) của cá thể mà DNA được bắt nguồn từ đó.Thư viện genomic DNA được dùng chủ yếu hoặc để sàng lọc hoặc để xác định vị trí và thứ tự của các trình tự trong genome.Các giai đoạn chính trong xây dựng thư viện genome: Cắt DNA. Gắn DNA vào vector. Đóng gói các dòng tái tổ hợp trong vỏ protein của phage. Chuyển cấu trúc đó vào tế bào vật chủ.Chương 5Tạo dòng genomic DNA của eukaryotevà xây dựng thư viện genomic DNACác bước trong xây dựng thư viện genomic DNAI. Xây dựng thư viện genomic DNA1. Cắt genomic DNA bằng các enzyme hạn chếDùng một lượng tối thiểu enzyme và ủ trong một thời gian ngắn.Phân đoạn và chọn lọc các đoạn có kích thước nằm trong phạm vi mong muốn.2. Tạo dòng các đoạn DNA để xây dựng thư viện genomeCác đoạn DNA thu được từ phản ứng cắt hạn chế được gắn in vitro vào vector tạo dòng nhờ DNA ligase.Giảm thiểu sự tự tái tạo lại vòng của vector bằng cách xử lý với alkaline phosphatase.Chọn vector tạo dòng tùy thuộc vào kích thước của các đoạn DNA:Plasmid: có thể chứa đoạn DNA dài 3-10 kbPhage: đoạn dài 15-23 kbCosmid: đoạn dài 35-45 kbBAC: đoạn dài >300 kbYAC: đoạn dài 100-2000 kb3. Đóng gói in vitro Nhờ các vị trí cos ở hai đầu 5’ và 3’ của các vector phage λ tái tổ hợp, các đầu rỗng của phage và các protein đóng gói. Các phân tử vector phage λ tái tổ hợp phải có chiều dài từ 38-52 kb. Các đầu phage được đóng gói sẽ hoàn thiện trong các tiểu thể phage xâm nhiễm in vitro khi có mặt sản phẩm của các gen W và FII, và các đuôi của phage. 4. Biến nạp vào tế bào vật chủ Tiền xử lý tế bào vi khuẩn E. coli với CaCl2 0,1 M. Ủ các tiểu thể phage xâm nhiễm in vitro với các tế bào đã tiền xử lý của vi khuẩn E. coli. Chọn lọc các dòng tái tổ hợp dựa trên khả năng kháng kháng sinh của chúng. Khuếch đại thư viện. II. Phân tích genomic DNA bằng lai SouthernNguyên tắc. Dựa vào phản ứng lai phân tử, dưới các điều kiện thích hợp 2 chuỗi nucleotide đơn sẽ tạo thành một phân tử lai.Phụ thuộc nhiều vào mức độ tương đồng của 2 chuỗi nucleotide.Các bước trong Southern blot: Phân tách các đoạn cắt hạn chế của genomic DNA bằng điện di agarose gel. Chuyển genomic DNA từ agarose gel lên màng lai. Lai các mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P (hoặc DIG-dUTP) với genomic DNA đã được cố định trên màng lai.Sơ đồ kỹ thuật Southern blot SM PC 1 2 3 4 5 6Điện di genomic DNA sau khi được cắt bằng enzyme hạn chế. SM: chuẩn kích thước DNA, PC: đối chứng dương tính, 1-6: các mẫu genomic DNA1. Phân tách các đoạn cắt hạn chế của genomic DNA bằng điện di agarose gelSơ đồ chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai bằng phương pháp thẩm tích nửa khô 2. Chuyển DNA từ agarose gel lên màng laiSơ đồ chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai bằng phương pháp mao dẫn Phân tích Southern blot. A: Phóng xạ tự ghi, B: Digoxigenin-dUTP3. Lai các mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ với các nucleic acid được cố định trên màng laiIII. Sàng lọc thư viện genomic DNADNA được tạo dòng trong các vector có nguồn gốc plasmid hoặc các vector nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC, YAC) sẽ sản xuất ra các khuẩn lạc.Các vector có nguồn gốc virus (bacteriophage) sẽ sinh tan tế bào bị chúng xâm nhiễm và sản xuất ra các plaque (vết tan).Một dòng chứa các chuỗi DNA quan tâm đặc biệt có thể được xác định bởi lai khuẩn lạc hoặc vế tan. Các vết tan của phage trên thảm vi khuẩn E. coli Sàng lọc thư viện gen trong khuẩn lạc vi khuẩn hoặc vết tan của bacteriophage λ IV. Các phương pháp đánh dấu để sản xuất mẫu dòV. Ứng dụng của thư viện genomic DNAỨng dụng trong phạm vị rộng để lập bản đồ vật lý của DNA và xác định các gen gây bệnh hoặc các chuỗi DNA quan tâm cho những phân tích sâu hơn.Sản xuất ra các dòng mang các đoạn chèn DNA khác nhau nhưng gối chồng lên nhau có nhiều thuận lợi và thư viện có thể được sử dụng trong quá trình chromosome walking. Chromosome walking cũng cho phép xây dựng một cấu trúc “clone contig”.Các thư viện genomic DNA cũng hữu ích trong việc xác định các gen gây bệnh bằng cách tạo dòng chức năng. VI. Phân tích trình tự của đoạn DNA được tạo dòng1. Phương pháp hóa học (Maxam-Gilbert)2. Phương pháp enzyme (Sanger)3. Phân tích trình tự nucleotide trên máy đọc tự động1. Phân tích trình tự nucleotide bằng phương pháp hóa học (Maxam-Gilbert )2. Phân tích trình tự nucleotide bằng phương pháp enzyme (Sanger)Máy phân tích trình tự nucleotide tự động và hình ảnh điện di các băng DNA phát huỳnh quang quan sát được trên computer3. Phân tích trình tự nucleotide trên máy đọc tự độngMinh họa trình tự nucleotide của một đoạn DNA Tạo dòng và xây dựng thư viện cDNAChương 6I. Tách chiết, tinh sạch và phân tích RNA1. Tách chiết và tinh sạch mRNATách chiết RNA tổng sốPhân lập RNA poly(A)+ từ RNA tổng số bằng sắc ký ái lực trên cột oligo(dT)-cellulose, các mRNA sẽ bám lên cột thông qua liên kết bổ sung với oligo(dT) và được thu nhận lại qua ly tâm.Quy trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số2. Phân tích RNA2.1. Lai Northern Phương thức này bắt nguồn từ Southern blot dựa trên cơ sở khả năng bổ sung của các nucleic acid sợi đơn để tạo thành các phân tử lai. RNA được phân tách theo kích thước trên agarose gel biến tính, thẩm tích và liên kết không thuận nghịch với màng nylon hoặc nitrocellulose, lai với mẫu dò nucleic acid được đánh dấu 32P (hoặc digoxingenin-dUTP). Ủ với phim X-quang.2.2. Lai Dot Chấm các mẫu nhỏ của dung dịch RNA lên màng nitrocellulose.Làm khô màng rồi lai với mẫu dò đặc hiệu RNA hoặc DNA có đánh dấu 32P.Ủ với phim X-quang. II. Tổng hợp cDNA Quá trình tổng hợp cDNA qua các giai đoạn sau: Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng enzyme reverse transcriptase. Cắt mRNA trong thể lai mRNA-cDNA bằng enzyme RNase H của E. coli. Thay thế chuỗi RNA bằng chuỗi DNA và tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA polymerase I của E. coli. Tạo đầu bằng của cDNA sợi đôi nhờ nuclease S1.Sơ đồ tổng hợp đoạn cDNA từ khuôn mẫu mRNA III. Tạo dòng phân tử của cDNA sợi đôi1. Các phương thức phổ biến Bổ sung các đuôi đồng trùng hợp (homopolymetric tailing) cho cDNA sợi đôi và cho DNA của plasmid vector. Bổ sung các đoạn nối tổng hợp (linker hoặc adapter) cho đầu tận cùng của DNA sợi đôi. Tạo dòng cDNA sợi đôi bằng đuôi đồng trùng hợp dG:dC. Minh họa một linker tổng hợp Minh họa một adapter tổng hợp IV. Các phương pháp tạo dòng cDNA khác1. Bổ sung tuần tự các linker khác nhau2. Tạo dòng cDNA bằng các primer-adapterTạo dòng cDNA bằng cách bổ sung tuần tự các linker khác nhau Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng phương pháp primer-adapter V. Các bacteriophage λ vector dùng trong tạo dòng cDNA1. Các bacteriophage λ vector được dùng phổ biếnVector λgt10. Dùng để xây dựng các thư viện chỉ được sàng lọc bằng các mẫu dò nucleic acid.Vector λgt11. Dùng để xây dựng các thư viện được sàng lọc bằng các mẫu dò miễn dịch để phân lập các chuỗi DNA mã hóa các kháng nguyên đặc hiệu.2. Một số bacteriophage λ vector khácVector λgt18 và λgt19Vector λgt20 và λgt21Vector λgt22 và λgt23Vector λZAPVI. Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm1. Các phương pháp sàng lọc (screening) Lai nucleic acid. Phát hiện các kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu.2. Xác nhận dòng cDNA quan tâm Biểu hiện của protein từ cDNA hoàn chỉnh thể hiện các hoạt tính sinh học hoặc enzyme chính xác. Tương ứng giữa các phần của chuỗi nucleotide của cDNA và các chuỗi amino acid của các peptide có nguồn gốc từ protein được tinh sạch. Tương ứng giữa bản đồ peptide của chuỗi polypeptide tổng hợp in vitro bằng sự phiên mã của dòng cDNA và bản đồ peptide của protein đích thực. Kết tủa miễn dịch của polypeptide tổng hợp in vitro hoặc in vivo từ sự phiên mã dòng cDNA bằng kháng thể tăng khả năng chống lại protein quan tâm. Kết tủa miễn dịch protein đích thực với kháng thể tăng khả năng chống lại các peptide tổng hợp mà các trình tự của chúng được xác định bởi trình tự nucleic acid của cDNA được tạo dòng.VII. Xây dựng thư viện cDNA trong bacteriophage λ vectorCác bước trong quá trình xây dựng thư viện cDNA:Chọn lọc kích thước của cDNAGắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage λPhân tích các đoạn xen cDNATạo thư viện cDNA hoàn chỉnhKhuếch đại thư viện cDNABiểu hiện gen tái tổ hợp trong Escherichia coliChương 7I. Vector biểu hiện Là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của chúng trong tế bào vật chủ. Vector này phải có đủ cấu trúc cần thiết sau: Gen chỉ thị chọn lọc. Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac). Các trình tự kiểm soát dịch mã như vùng liên kết ribosome được bố trí thích hợp và codon khởi đầu ATG. Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác với promoter. II. Sản xuất các protein dung hợp1. Protein dung hợpProtein dung hợp được mã hóa bởi một gen lai do sự dung hợp in vitro các đoạn gen khác nhau. Sự dung hợp gen được thực hiện bằng cách gắn phần mã hóa của gen được tạo dòng ở gần đầu tận cùng 3’ của gen lacZ. Protein dung hợp có những ưu điểm sau:Thường được sản xuất với hàm lượng lớn.Dung hợp các trình tự ngoại lai với các gen của E. coli thường cho kết quả các sản phẩm ổn định hơn các protein ngoại lai nguyên thể.Protein dung hợp lớn hơn so với hầu hết các protein của E. coli và vì thế dễ dàng nhận biết trong điện di gel của protein. Protein dung hợp có thể được tiết ra môi trường nhờ biểu hiện của vi khuẩn nếu gen eukaryote được gắn với trình tự mã hóa cho peptide tín hiệu. Protein dung hợpCác vector họ pUR2. Các hệ thống vector biểu hiện các gen dung hợp với gen lacZVector pEX2 3. Xây dựng plasmid biểu hiện và phát hiện các protein dung hợpGắn plasmid vector (pUR hoặc pEX) thích hợp với đoạn DNA ngoại lai để tạo ra một sự dung hợp trong khung đọc. Biến nạp các vector này vào E. coli. Kiểm tra các khuẩn lạc riêng biệt mang đoạn DNA ngoại lai mong muốn.Sàng lọc các khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp.4. Tách chiết các protein dung hợp để sản xuất kháng thể Protein dung hợp có thể được tách chiết theo một số phương pháp sau: Dùng dịch chiết urea.Sắc ký ái lực aminophenylthiogalactoside.Điện di SDS-polyacrylamide gel.III. Sản xuất các protein nguyên thểCác protein nguyên thể có thể được sản xuất trong E. coli bằng cách sử dụng promoter mạnh và một vùng liên kết ribosome hiệu quả. Để biểu hiện gen prokaryote có vùng liên kết ribosome mạnh chỉ cần cung cấp một promoter là đủ. Để biểu hiện một gen eukaryote (hoặc một gen prokaryote với một vùng liên kết ribosome yếu) cần phải cung cấp cả promoter lẫn vùng liên kết ribosome. Các mức độ biểu hiện có thể khác nhau từ dưới 1% cho tới hơn 30% protein tổng số của tế bào.Protein nguyên thể1. Biểu hiện của các gen ở prokaryote: PromoterChọn một vector biểu hiện mang promoter mạnh của prokaryote. Các promoter thích hợp nhất cho biểu hiện của gen ngoại lai ở E. coli là những promoter mà cả hai cường độ và khả năng điều chỉnh thể hiện mạnh.Vector pKC30 pKK177-3 là vector tac chứa các vị trí tạo dòng gen ngoại lai cùng hướng với promoter tacVector pET-3 mang promoter (PФ10) của bacteriophage T7 Ф10 và yếu tố kết thúc phiên mã Ф (TФ)2. Biểu hiện của các gen ở eukaryote: Các promoter và vùng liên kết ribosomeSử dụng vùng liên kết ribosome để đảm bảo chắc chắn mRNA được dịch mã một cách có hiệu quả. Hiệu suất dịch mã của mRNA chịu sự chi phối của một vài yếu tố:Mức độ bổ trợ giữa chuỗi SD và đầu 3’ của 16S rRNA.Không gian và khả năng để chuỗi DNA nằm giữa chuỗi SD và codon ATG. Nucleotide theo sau ATG ảnh hưởng đến sự liên kết ribosome.Vector pAS1 IV. Xác định mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng1. Kỹ thuật SDS-PAGE Điện di trên polyacrylamide gel có mặt sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE) cho phép phân chia các phân tử protein có khối lượng khác nhau.WM 1 2 3 4 5 6 7Điện di SDS và nhuộm bằng Coomasie blue. WM: Chuẩn khối lượng phân tử của protein. Các đường từ 1-7: Các mẫu protein 2. Kỹ thuật Western blotDựa trên cơ sở phản ứng lai kháng nguyên-kháng thể.Sơ đồ kỹ thuật Western blot Liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme trong Western blotTín hiệu lai giữa kháng nguyên và kháng thể ở Western blot. WM: Chuẩn khối lượng phân tử của protein. Các đường 1, 2 và 4: có tín hiệu lai. 3: không có tín hiệu lai3. ELISA Nguyên lý tương tự Western blot. Kỹ thuật này dùng để định lượng protein kháng nguyên.