An toàn phòng thí nghiệm và một số kỹ thuật cơ bản phòng thí nghiệm

Phạm Thị Vinh HoaBộ môn Vi sinh - Ký sinh trùngKhoa Y học cơ sởAN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM&MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN PHÒNG THÍ NGHIỆMMỤC TIÊU HỌC TẬPSau khi học, học viên có khả năng:Trình bày được các nguyên tắc an toàn PTN Trình bày và thực hiện được một số kỹ thuật về sử dụng các thiết bị/dụng cụ cơ bản trong PTN.NỘI DUNG BÀI GIẢNG1. An toàn phòng thí nghiệmAn toàn sinh học PTNAn toàn hóa chất, cháy nổ PTNCác mối nguy khác2. Nội quy phòng thí nghiệm3. Một số kỹ thuật cơ bản phòng thí nghiệmSử dụng cân phân tích Pha và chuẩn bị môi trường Sử dụng pipetSử dụng dụng cụ thủy tinhSử dụng nồi khử trùngSử dụng tủ nuôi cấyAN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆMSAFETY IS NO ACCIDENTSAFETY IS NO ACCIDENTAN TOÀN SINH HỌC PTN An toàn sinh học: - Thao tác an toàn trên vật liệu sinh học, và tác nhân truyền nhiễm. - Những nguyên tắc phòng ngừa, các kỹ thuật và thực hành để ngăn chặn sự phơi nhiễm không mong muốn với các tác nhân gây bệnh và các độc chất, hoặc vô tình làm thất thoát/phát tán chúng. Biosafety is the safe working practices associated with handling of biological materials, particularly infectious agents. It addresses containment principles, technologies and practices that are implemented to prevent the unintentional exposure to pathogens and toxins, or their accidental release.. TOÀN SINH HỌC PTN- Nguy cơ từ mẫu kiểm nghiệm, mẫu nghiên cứu, mẫu bệnh phẩm:Vi khuẩnVirusKý sinh trùngĐộng vật thí nghiệm Nhóm nguy cơ  Phòng thí nghiệmMối liên quan giữa các nhóm nguy cơ với cấp độ, tiêu chuẩn thực hành và trang thiết bị an toàn sinh họcTài liệu: Cẩm nang ATSH PTN – WHO - 2004 AN TOÀN SINH HỌC PTNAN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTNNguy cơ hóa học:- Hóa chất gây cháy, nổ- Phản ứng hóa chât nhầm- Hóa chất độc- Hóa chất dễ bay hơiPhơi nhiễm với hóa chất nguy hiểm:Hít phảiTiếp xúcNuốt phảiBị kim châmBị thâm nhập qua vùng da hởNever taste, smell, or touch chemicals Quy định chung với những hóa chất kỵ nhauTài liệu: Cẩm nang ATSH PTN – WHO - 2004 AN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTNCác loại bình cứu hỏa và cách sử dụngTài liệu: Cẩm nang ATSH PTN – WHO - 2004 AN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTNAN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTNAN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTNCÁC MỐI NGUY KHÁC- Điện Thiết bị điện nối đất, nối mát (ổ phích 3 chạc)- Tiếng ồn- Tia phóng xạ- Vật dụng sắc nhọn, thủy tinh dễ vỡMột số biểu tượng cảnh báo nguy hiểm trong PTNNỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆMNỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆMBẠN KHÔNG NÊNBẠN NÊN Mang đồ bảo hộ: găng tay, kính, khẩu trang, mũ chùm đầu, áo blouse Cột gọn tóc phía sau Đi giầy/dép kín bàn chân Mặc đồ dài, gọn gàngTuân thủ các nội quy PTNKHI CÓ VẤN ĐỀ XẢY RA TRONG PTN? Cháy, nổ hóa chất Đổ hóa chất, chất bẩn Đổ vỡ dụng cụ thủy tinh Vật sắc nhọn cắt Xử lý và báo cho cán bộ phụ trách PTNXỬ LÝ PHỎNGXỬ LÝ ĐỨT TAYXỬ LÝ CHÁYSỬ DỤNG MỘT SỐ THIẾT BỊ- DỤNG CỤ CƠ BẢN TRONG PTNSỬ DỤNG CÂN PHÂN TÍCHCÂN PHÂN TÍCH- Cân phân tích điện tử: 0.01, 0.0001 gram- Độ chính xác cao- Cân hóa chất, môi trường, mẫu trong PTNSỬ DỤNG CÂN PHÂN TÍCHKiểm tra nguồn điện trước khi cắm.Nhấn phím ON/OFF để bật cân, màn hình hiển thị chữ số 0.00gNếu màn hình không hiển thị chữ số 0.00g phải nhấn vào phím T chờ các số trên màn hình ổn định và hiện 0.00g. Khi cân đã ổn định, màn hình hiển thị số 0.00g, bắt đầu thực hiện phép cân.Đặt nhẹ nhàng mẫu cần cân lên đĩa cân.Chờ đến khi các số hiển thị trên màn hình ổn định, ghi nhận giá trị cân được.Lấy vật cân ra.Khi xong phải nhấn phím ON/OFF để cân ở trạng thái không làm việc.THỰC HÀNH CÂN- Cân và pha 100 ml môi trường LTS Cân và pha 50 ml môi trường peptone Cân và pha 100 ml môi trường EC Cân và pha 50 ml môi trường tryptonSỬ DỤNG PIPETPIPETPipet pasteur bằng thủy tinh không chia vạchPipet chia vạch bằng nhựa hoặc bằng thủy tinhPipet bán tự động một kênh và nhiều kênhPIPET CHIA VẠCHCách sử dụng pipet với quả bóp cao su hoặc trợ pipet- Cắm sâu đầu dưới của pipet vào dung dịch. - Hút tráng pipet hai hoặc ba lần bằng dung dịch định hút. Cầm pipet ở tư thể thắng đứng, chạm đầu dưới của pipet vào thành bình hứng để ở tư thế nghiêng, cho dung dịch chảy từ pipet vào bình. Để cho dung dịch chẩy tự do xuống bình, đợi 3 giây, đầu pipet vẫn chạm vào thành bình hứng. Không sử dụng quả bóp cau su hoặc trợ pipet đẩy hết giọt cuối cùng còn đọng lại ở đầu pipet để tránh tạo khí dung.PIPET CHIA VẠCHRửa pipet và các quy trình cần thực hiện để tái sử dụng Pipet thủy tinh sau khi sử dụng cần được sấy khử trùng, dùng kẹp nhỏ lấy bông ở đầu trên ra rồi ngâm vào dung dịch tẩy rửa đồ thủy tinh, sau đó rửa, sấy khô, đóng gói để tái sử dụng. Pipet chia vạch chất liệu bằng nhựa đã vô trùng (sử dụng một lần): cách sử dụng như pipet chia vạch chất liệu bằng thủy tinh: lấy ra khỏi bao giấy, sử dụng, sấy khử trùng rồi hủy.PIPET CHIA VẠCHCách cầm pipet     a. Cái móc: cầm Pipet nghiêng về một phía hơi cách lỏng lẻo trên sống bàn tay khi không sử dụng, như vậy sẽ làm cơ tay ít bị quá sức.     b. Cầm chặt bằng cả bàn tay: Tránh cầm pipet quá chặt để giảm mỏi cơ tay và cơ vai sau khi sử dụng pipet lâu.     c. Để lộ phần ghi số thể tích: có thể nhìn trong suốt thời gian để có thể kiểm soát thể tích lấy ngay cả khi đang sử dụng.    d. Nút bật lớn: để một khoảng cách thuận lợi trong khoảng với của ngón tay cái và có một diện tích bề mặt rộng để làm giảm mỏi ngón tay cái.PIPET BÁN TỰ ĐỘNGPIPET BÁN TỰ ĐỘNGCách cầm pipetPIPET BÁN TỰ ĐỘNGChuyển tất cảphần còn lạicủa chất lỏngở đầu pipet tipra, ấn tới nấcdừng thứ hai(để phụt hếtdung dịch rakhỏi pipet tip)Để cho mẫu,ấn tới nấcdừng thứ nhấtThả pittông ra từ từẤn tới nấcdừng thứ nhất.Nhúng đầupipet tipkhoảng 3 – 4mm vào dungdịchCầm pipet ở tưthế thắng đứngCách lấy mẫu theo chiều xuôi (Forward method)PIPET BÁN TỰ ĐỘNGCách lấy mẫu theo chiều ngược (Backward method)Cầm pipet ở tư thế thắng đứng.Ấn tới nấc dừng thứ hai. Nhúng đầu pipet tip khoảng 3 – 4 mm vào dung dịch.Thả pittông ra từ từ.Để cho mẫu, ấn tới nấc dừng thứ nhất. Loại bỏ phần dung dịch còn lại ở pipet tip.PIPET BÁN TỰ ĐỘNGKiểm tra lấy mẫuTHỰC HÀNH SỬ DỤNG PIPETSử dụng pipet bán tự động lấy 200 μl đỏ phenol.Sử dụng pipet chia vạch hút 9 ml dung dịch cho vào ống nghiệm. SỬ DỤNG DỤNG CỤ THỦY TINH- Chịu hóa chất: là thủy tinh trung tính, chịu được hầu hết các hóa chất, dung dịch ăn mòn mạnh ở nhiệt độ cao (ngoại trừ HF là dung dịch acid có độ ăn mòn cao nhất thậm chí tại nồng độ thấp).- Tính chất nhiệt: chịu được nhiệt độ cao, shock nhiệt.- Dụng cụ thủy tinh dùng cho phòng thí nghiệm cần phải sạch về mặt hoá học (không dính các chất hữu cơ hoặc vô cơ) và sạch về mặt vi sinh vật học (không chứa bất kỳ tế bào vi sinh vật hay bào tử của chúng). Do vậy, trước khi sử dụng thì cần được rửa sạch và khử trùng.YÊU CẦU VỚI DỤNG CỤ THỦY TINH TRONG PTNBình tam giác, bình cầu:- Chuẩn độ; chứa đựng môi trường, dung dịch; nuôi cấy vi sinh vật; thực hiện các phản ứng.- Thể tích: 50ml -10 lítỐng đong, cốc đong:- Đong không cần độ chính xác cao.- Chọn ống đong phù hợp. - Đặt ống đong trên một mặt phẳng và tầm mắt ngang tầm với bề mặt chất lỏng.DỤNG CỤ THỦY TINH TRONG PTNĐĩa petri:- Nuôi cấy, phân lập các chủng vi sinh vật hoặc làm các test chẩn đoán, kháng sinh đồ khoanh giấy, các thử nghiệm tính cạnh tranh giữa các chủng vi sinh... Ống nghiệm:- Chứa đựng dung dịch với dung tích nhỏ; nuôi cấy VSV trên môi trường lỏng hoặc môi trường thạch, thử các tính chất sinh vật hoá học...DỤNG CỤ THỦY TINH TRONG PTNSau khi tiệt trùng dụng cụ bẩn, tháo bỏ nút bông, môi trường, thạch, cặn bẩn chứa trong dụng cụ.Tráng dụng cụ bằng nước để loại hết cặn bẩn.Dùng miếng nhám thấm xà phòng hoặc bông thấm cồn để lau sạch các ký hiệu ghi bằng bút dạ trên thủy tinh.Nếu dụng cụ bẩn nhiều hoặc dính dầu mỡ, ngâm các dụng cụ đó vào dung dịch sunfocromic trong nhiều giờ sau đó rửa lại.Dụng cụ sau khi rửa phải đảm bảo pH đạt đến trung tính, úp ngược dụng cụ cho ráo nước, làm khô ở nhiệt độ phòng hoặc đem sấy ở nhiệt độ 600C - 800C trong vài giờ. Sau đó cất giữ đồ thủy tinh khô hoặc bao gói chúng để đem đi khử trùng.RỬA DỤNG CỤ THỦY TINHRửa ống nghiệmLàm nút bông ống nghiệmĐóng gói ống nghiệm để khử trùngĐóng gói đĩa petri để khử trùngTHỰC HÀNH SỬ DỤNG DỤNG CỤ THỦY TINHSỬ DỤNG NỒI KHỬ TRÙNGNỒI KHỬ TRÙNG- Hơi nước căng ở áp suất cao 120oC / 30 phút 134oC / 15 phút - Tiệt trùng: dụng cụ kim loại, đồ vải, cao su, một số chất dẻo và dung dịch lỏngKiểm tra chất lượng tiệt trùng bằng chỉ điểm: Giấy chỉ thị khử trùngSỬ DỤNG NỒI KHỬ TRÙNGKiểm tra: nước, đồng hồ đo áp suất, van xả hơi nướcCho dụng cụ/môi trường cần khử trùng vào lồng inox và đặt vào nồiĐóng nắp nồi (Lock)Bật nguồn điện (Power ON/OFF)Chọn chương trình cần sử dụng (Mode 1, 2, 3)Bấm nút khởi động (Start)Theo dõi quá trình hoạt động (ERROR, T0, ATM)Khi nồi dừng hoạt động (stand by complete: ~50oC-0atm) mở cửa nồi (Unlock)Dùng găng tay chịu nhiệt lấy đồ khử trùngKiểm tra nướcTắt nguồn điện (Power ON/OFF)SỬ DỤNG TỦ NUÔI CẤYTỦ NUÔI CẤY Nhiệt độ nuôi cấy: 28, 37, 44oC Khí CO2- Bật nguồn điện (Power ON/OFF)- Chọn nhiệt độ thích hợp (SET + INCREASE/DECREASE)- Đặt đĩa thạch/ống nghiệm cần nuôi cấy vào trên giá- Đóng cửa tủ và chốt- Theo dõi (ERROR, To)SỬ DỤNG TỦ NUÔI CẤY